于俊民，張小波，李大鶴，王慧冬，趙園園，沈偉偉

胰島素樣生長因子（IGF-1）是重要的心源性激素，參與機體整個動脈粥樣硬化形成過程。IGF-1通過與分布體內(nèi)多種組織、器官的胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R）結(jié)合，在冠心病、內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤及肝、腎、心肌纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。心肌纖維化（MF）是由于心肌膠原纖維過量沉積及比例失調(diào)最終導(dǎo)致心功能不全的一種病理變化，是心肌梗死后惡性心律失常的關(guān)鍵影響因素[1]，如何調(diào)控MF的發(fā)展進程，對于改善心肌梗死（MI）預(yù)后具有重要的臨床意義。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）在改善梗死后心肌纖維化方面的作用已得到證實，前期研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦可影響老年非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者血中TGF-β1、CTGF的水平[2]，但厄貝沙坦對心肌梗死患者血中及組織中IGF-1、IGF-1R的影響尚未見報道。實驗通過觀察大鼠心肌梗死后心肌組織中IGF-1、IGF-1R的表達，并給予厄貝沙坦干預(yù)，進而探討IGF-1、IGF-1R對心肌梗死預(yù)后的影響，為心肌纖維化防治提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級Wistar雄性大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）；實時PCR儀（ABI 7500）；IGF-1、IGF-1R及GAPDH引物（TaKaRa）；RT試劑盒（Promega）；抗IGF-1抗體、抗IGF-1R抗體（Abcam）；抗GAPDH抗體（CST）；裂解液Trizol reagent（Invitrogen）；HRP標記的Ⅱ抗（碧云天）；RIP組織細胞快速裂解液（Solarbio）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo）；NC膜（Millipore）；厄貝沙坦（商品名：安博維；德國賽諾菲制藥公司）。

1.2 心肌梗死模型的制備大鼠稱重，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管后連接小動物呼吸機有氧正壓通氣。于左側(cè)胸腔第4肋間逐層開胸，開放心包后擠壓右側(cè)胸腔使心臟暴露于胸腔外，用絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，將心臟放回正常位置，并逐層縫合胸腔?；謴?fù)自主呼吸后拔管，保溫待其清醒。假手術(shù)組，采用相同的方法開胸、穿線，僅在冠狀動脈下留置絲線，不結(jié)扎，余與制模組相同。

1.3 實驗分組選擇建模后24 h存活大鼠隨機分為藥物組（n=9）、對照組（n=9），另設(shè)假手術(shù)組（n=9）。藥物組給予厄貝沙坦50 mg·kg/d，連續(xù)4周，對照組及假手術(shù)組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，4周后處死。

1.4 大鼠左心室重量測定4周時大鼠稱重，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔麻醉，心腔內(nèi)注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期，稱取左心室重量。

1.5 心肌病理改變大鼠心肌組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，切片脫蠟，二甲苯透明，蘇木精-伊紅染色（HE）染色，光鏡觀察各組大鼠的心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 IGF-1、IGF-1R mRNA檢測應(yīng)用Real-time PCR方法檢測各組大鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA水平。提取各組大鼠心肌組織，按照Trizol試劑盒操作步驟進行RNA提取 ，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ，將制備好的cDNA進行PCR擴增，數(shù)據(jù)采用儀器自帶ABI Prism 7300 SDS Software分析。實時定量PCR的數(shù)據(jù)應(yīng)用2-△△Ct方法計算。

IGF-1的上游引物序列5’-GCACTCTGCTTGCTC ACCTTTA-3’，

下游引物序列為5’-TCCGAATGCTGGAGCCATA-3’；

IGF-1R的上游引物序列為5’-GGTCTCTAAGGC CAGAGGTGGA-3’，

下游引物序列為5’-GACGAACTTGTTGGCATTG AGGTA-3’；

GAPDH的上游引物序列為5’- GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA-3’,

下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG-3’。

1.7 IGF-1、IGF-1R蛋白檢測將新鮮組織剪成碎片，按每20 mg組織加入150～250 μl裂解液比例加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000×g離心15 min，取上清，進行蛋白質(zhì)定量，采用半干式轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，甲醇活化后用TBST洗后進行封閉。封閉后進行I抗孵育，根據(jù)說明書IGF-1 1:2500、IGF-1R 1:500稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h。孵育I抗的膜用TBST洗滌5 min×3次。隨后根據(jù)用量，按照1:1500稀釋HRP標記的Ⅱ抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌5 min×3次。最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測顯色條帶強弱。以目的蛋白條帶的強度與內(nèi)參照蛋白強度的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌病理變化HE染色可見假手術(shù)組心肌細胞排列規(guī)則，對照及藥物組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞腫脹、斷裂，細胞核溶解，炎性細胞浸潤，藥物組改變較對照組減輕（圖1）。

2.2 大鼠左心室重量各組大鼠體重無統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0.05）；左心室重量的比較中，藥物組和對照組高于假手術(shù)組，對照組高于藥物組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。

2.3 大鼠心肌組織IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白表達大鼠心肌組織中均可檢測到IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白水平。藥物組及對照組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白含量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；藥物組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2、圖2）。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色（×400）

表1 各組大鼠體重、左心室重量情況

表2 各組大鼠IGF-1、IGF-1R的mRNA及蛋白的表達情況

圖2 大鼠缺血心肌IGF-1、IGF-1R蛋白表達

3 討論

IGF-1作為胰島素家族的一類多肽，是一種多功能細胞增殖調(diào)控因子。有學(xué)者認為IGF-1參與新生心肌纖維的增殖，在成熟心肌細胞中具有加強心肌纖維生長的功能[3]，同時IGF參與多種心臟生理病理過程，在急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中有重大意義[4]。胰島素樣生長因子-1受體普遍分布于心血管系統(tǒng)，屬于酪氨酸蛋白激酶傳導(dǎo)系統(tǒng)，由4個亞基組成，主要接受IGF-1的刺激。IGF-1與IGF-1R結(jié)合后可激活多種信號通路，對心肌纖維化和心肌肥厚起到調(diào)節(jié)作用。

心肌纖維化在心室重構(gòu)的過程中會導(dǎo)致心肌功能、代謝、傳導(dǎo)異常，發(fā)展成為心力衰竭、心肌疾病及各種心律失常等心臟疾病[5]。心肌梗死后心室重塑、心肌纖維化，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS系統(tǒng)）的激活，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1（AT1）型受體結(jié)合，介導(dǎo)心室重塑過程中一系列生物化學(xué)反應(yīng)。ARB在受體水平完全阻斷血管緊張素作用降低末梢血管阻力，抑制腎上腺分泌醛固酮，改善舒張功能，防止心室重構(gòu)。心肌梗死后心肌局部AngⅡ增加，導(dǎo)致膠原合成增加，加速心肌纖維化的進程[6]。厄貝沙坦能夠有效抑制AngⅠ向AngⅡ的轉(zhuǎn)換，同時對AT1也具有特異性拮抗作用[7-9]。

有文獻報道厄貝沙坦可以通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）表達,調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)（ECM）的降解和合成，減輕高血壓導(dǎo)致的心室肌纖維化[10]，在心肌梗死后重構(gòu)早期階段的抗炎作用可以改善心肌梗死預(yù)后[11]，另有報道纈沙坦可以抑制AngⅡ的釋放，降低MMP-2和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9），從而減少膠原蛋白的累積，防止心肌纖維化的進展[12]，Tang等觀察到糖尿病大鼠經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后減輕糖尿病心肌病的損傷程度[13]。本實驗通過建立大鼠心肌梗死模型，給予厄貝沙坦治療4周后發(fā)現(xiàn)藥物組大鼠心肌病理變化明顯改善，且左心室重量明顯低于對照組，證實了厄貝沙坦對心肌梗死后大鼠缺血心肌的保護作用。

Galie等[14]通過對大鼠心肌纖維化模型觀察，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)成纖維細胞使IGF-1和血管內(nèi)皮生長因子分泌顯著增加，以促進缺血心肌形成旁分泌環(huán)境，介導(dǎo)纖維化過程。心肌梗死后心肌缺血性損傷刺激心肌細胞合成炎癥細胞因子，同時梗死心肌釋放多種抗原引發(fā)自身免疫反應(yīng)促使炎癥發(fā)生。急性炎癥是纖維化的起始，隨后發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧環(huán)境改變等上調(diào)纖維化相關(guān)基因的表達[15]，有研究發(fā)現(xiàn)炎性因子可促進上皮細胞表達IGF-1、IGF-1R[16]，有學(xué)者證實IGF-1介導(dǎo)的信號通路與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在心室重塑的過程中存在協(xié)同作用[17]。實驗觀察到心肌梗死大鼠應(yīng)用厄貝沙坦治療4周后，藥物組及對照組大鼠心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白水平明顯高于假手術(shù)組，且藥物組IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白明顯低于對照組，表明厄貝沙坦可以調(diào)控大鼠梗死心肌組織中IGF-1、IGF-1R mRNA、蛋白表達，抑制IGF-1、IGF-1R水平，從而推測IGF-1、IGF-1R參與了厄貝沙坦對缺血心肌的保護作用。

心肌纖維化已成為研究心肌梗死后心力衰竭的治療靶點。心肌梗死后膠原降解過度，異常膠原沉積，廣泛心肌纖維化使心室壁硬度增加，順應(yīng)性減低，影響心臟的收縮和舒張功能，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[18,19]。曾有學(xué)者報道高血壓患者外周血IGF-1水平與其心血管重構(gòu)具有緊密聯(lián)系[20]，充血性心力衰竭時IGF-1介導(dǎo)并參與心肌重構(gòu)[21]，以往研究證實厄貝沙坦可影響大鼠缺血心肌組織中肝細胞生長因子（HGF）水平[22]，本實驗觀察到厄貝沙坦同時可抑制梗死大鼠心肌組織IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白表達，表明IGF-1/IGF-1R信號通路與其他炎癥因子共同參與了心肌梗死后心室重構(gòu)心肌纖維化過程，從分子水平為心肌梗死后心肌纖維化機制的研究奠定了基礎(chǔ)，為厄貝沙坦的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。由于本實驗樣本量較小，在心肌梗死后心肌纖維化的過程中，是否存在細胞因子與信號通路間的相互影響尚需進一步探討。