羅翠竹 王小明 周云

摘要：目的 ?探討MTHFR C677T基因多態(tài)性（SNP）與膿毒血癥的關(guān)系。方法 ?選擇2014年1月～2018年6月我院住院的膿毒血癥患者98例，采用梯度PCR及DNA測序技術(shù)，檢測MTHFR C677T基因型，比較不同T淋巴細(xì)胞凋亡比例膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T基因型分布情況及MTHFR C677T多態(tài)性與膿毒血癥的關(guān)系。結(jié)果 ?MTHFR C677各位點基因型在T淋巴細(xì)胞中的凋亡比例方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;APACHEⅡ<4分，SOFA<2分的CT比例高于CC與TT基因型，降鈣素原減少比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），28 天死亡人數(shù)比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?MTHFR C677T與膿毒血癥患者預(yù)后有關(guān)，可根據(jù)MTHFR C677T的基因多態(tài)性預(yù)測膿毒血癥的預(yù)后。

關(guān)鍵詞：膿毒血癥;亞甲基四氫葉酸還原酶;單核苷酸多態(tài)性;死亡率

中圖分類號：R459.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.031

文章編號：1006-1959（2019）21-0101-03

Abstract：Objective ?To investigate the relationship between MTHFR C677T gene polymorphism （SNP） and sepsis.Methods 98 patients with sepsis hospitalized in our hospital from January 2014 to June 2018 were selected. Gradient PCR and DNA sequencing techniques were used to detect the MTHFR C677T genotype and compare the proportion of different T lymphocyte apoptosis patients with sepsis. The distribution of MTHFR C677T genotype and the relationship between MTHFR C677T polymorphism and sepsis.Results There was no significant difference in the proportion of MTHFR C677 genotypes in T lymphocytes （P>0.05）. APACHEII<4 points， SOFA<2 points had higher CT ratio than CC and TT genotypes. The proportion of procalcitonin reduction was lower than CC genotype and CT genotype，the difference was statistically significant （P<0.05）. The proportion of deaths in 28 days was lower than that of CC genotype and CT genotype，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion MTHFR C677T is associated with the prognosis of patients with sepsis. The prognosis of sepsis can be predicted based on the gene polymorphism of MTHFR C677T.

Key words：Sepsis;Methylenetetrahydrofolate reductase;Single nucleotide polymorphism;Mortality

膿毒血癥（sepsis）是由于機(jī)體遭受感染襲擊，威脅患者的機(jī)體免疫系統(tǒng)[1]，可能危及患者生命，可造成機(jī)體炎癥反應(yīng)加重，引起多器官衰竭，自身組織細(xì)胞破壞[2]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR） 是葉酸代謝中的限速酶，對于甲氨蝶呤（MTX）藥理作用的發(fā)揮起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其單核苷酸基因多態(tài)性（SNP）對于嚴(yán)重炎癥反應(yīng)具有一定的相關(guān)性[3]。不同 MTHFR C677T 基因型患者淋巴細(xì)胞凋亡存在明顯差異[4]，需要進(jìn)一步研究MTHFR C677T 基因型對膿毒血癥患者免疫功能的影響[5]。本研究擬比較不同 MTHFR C677T 基因型患膿毒血癥時，T淋巴細(xì)胞凋亡的比例及死亡率有無差異，為臨床提供治療參考依據(jù)，可為膿毒血癥的預(yù)后提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料 ?納入2014年1月～2018年6月萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院收治的膿毒血癥患者98例作為研究對象。本研究獲醫(yī)院倫理評審委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書。年齡40～60歲，平均年齡（62.36±2.14）歲，男64例，女34例;T淋巴細(xì)胞凋亡比例<20%有43例，20%～60%有39例，≥60%有16例。臨床嚴(yán)重程度分級：低危組43例，女16例，男27例，年齡40～60歲，平均年齡（55.76±2.38）歲;中危組39例，女12例，男27例，年齡40～60歲，平均年齡（59.94±2.64）歲;高危組16例，女5例，男11例，年齡40～60歲，平均年齡（66.03±2.26）歲;三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 ?Reverse Transcriptase XL 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TAKARA公司，瓊脂糖購自西班牙Pharmerisco 公司，QIAamp ?RNA Blood Mini Kit 試劑盒購自天根生化科技，所有引物均由華大基因科技公司合成。主要儀器為核酸電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）/梯度PCR檢測儀（德國Biometra公司）。

1.2.2 RNA提取及cDNA制備 ?均按試劑盒說明書操作，使用QIAamp ?RNA試劑盒提取總RNA，抽取患者外周血2 ml，EDTA抗凝并于-70℃保存，制備cDNA采用Reverse Transcriptase XL逆轉(zhuǎn)錄試劑。

1.2.3引物設(shè)計 ?MTHFR C677T的引物設(shè)計由上海生工設(shè)計，Genbank獲取MTHFR核苷酸序列。突變探針MTHFR 677T：5'-熒光基團(tuán)-CGGG+AG+T+CGATTT-淬滅基團(tuán);野生探針MTHFR 677C：5'-熒光基團(tuán)-CGGG+AG+C+CGATTT-淬滅基團(tuán)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 ?MTHFR C677T的總反應(yīng)體系為50 μl：去離子水17 μl、正向與反向引物（10 μmol /L）各2 μl、Mix（2×）25 μl、DNA模板4 μl。反應(yīng)條件均為：94 ℃變性30 s，95℃預(yù)變性2 min，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行36個循環(huán)，72℃ 延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物電泳及測序 ?加入3%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，取待測PCR產(chǎn)物5.0 μl及Marker 7.5 μl，電壓為60 mV，電泳60 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 T淋巴細(xì)胞凋亡比例分析 ?收集空腹新鮮外周血，加CD3抗體和膜聯(lián)蛋白5抗體，CD3抗體和膜聯(lián)蛋白5抗體均從Elabscience公司購買。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞凋亡比例，所有試驗操作嚴(yán)格按照有關(guān)說明書進(jìn)行，MTHFR C677各位點基因型在T淋巴細(xì)胞中的凋亡比例，按照凋亡占比進(jìn)行比較。

1.4觀察指標(biāo) ?比較不同T淋巴細(xì)胞凋亡比例膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T基因型分布情況及MTHFR C677T多態(tài)性與膿毒血癥的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 ?本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料（%）表示，采用？字2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同T淋巴細(xì)胞凋亡比例膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T基因型分布情況 ?膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T位點：TT純合型19例（19.39%）、CT雜合型46例（46.94%）、CC野生型33例（33.67%）。MTHFR C677基因型在T淋巴細(xì)胞中的凋亡比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 MTHFR C677T多態(tài)性與膿毒血癥的關(guān)系 ?98例膿毒血癥患者中，APACHEⅡ<4分，SOFA<2分的CT比例高于CC與TT基因型，降鈣素原減少比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;28 天死亡人數(shù)比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3討論

膿毒血癥由于細(xì)菌或者感染灶引起的全身炎癥性反應(yīng)綜合征，該病對患者的生命具有嚴(yán)重威脅 ?性[4]。已有的研究對其機(jī)制的探討主要集中在免疫攻擊方面，當(dāng)機(jī)體遭受到感染的侵襲時，可引起細(xì)胞和組織的破壞，造成機(jī)體全身免疫炎癥系統(tǒng)破壞，出現(xiàn)多器官功能衰竭。膿毒血癥患者普遍存在免疫功能低下，中性粒細(xì)胞凋亡延遲，淋巴細(xì)胞凋亡增 ? ?加[5]。亞甲基四氫葉酸還原酶基因 C677T，即 MTHFR C677T，在人群中存在普遍多態(tài)性，表現(xiàn)為 MTHFR C677CC，MTHFR C677CT， MTHFR C677TT三種基因型[6]。目前已有研究表明MTHFR C677T 基因多態(tài)性與腫瘤、心血管疾病、白血病、抑郁癥等多種疾病相關(guān)[7];此外，不同 MTHFR C677T 基因型，其淋巴細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性存在明顯差異，MTHFR C677CC基因型遺傳穩(wěn)定性顯著高于MTHFR C677TT，MTHFR C677CC 基因型淋巴細(xì)胞凋亡明顯減少[8]。目前關(guān)于不同 MTHFR C677T 基因型患膿毒血癥時，不同基因型淋巴細(xì)胞凋亡的比率及患者死亡率有無差異，目前研究報道較少[9]。

已有研究結(jié)果顯示，不同種族、地區(qū)人群MTHFR的SNP的突變有所差異。本研究通過對MTHFR C677T基因位點的變異了解其對膿毒血癥預(yù)后的影響效應(yīng)。首先檢測了不同T淋巴細(xì)胞凋亡比例膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T基因型分布情況，結(jié)果顯示MTHFR C677各位點基因型在T淋巴細(xì)胞凋亡的比例上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明不同T淋巴細(xì)胞凋亡情況對MTHFR C677T基因型分布并未產(chǎn)生明顯影響。目前研究提示，膿毒血癥與MTHFR C677T 關(guān)系有著不同的觀點，有研究顯示677CT/TT 基因型會使膿毒血癥患者出現(xiàn)血炎癥水平升高的風(fēng)險增加，導(dǎo)致預(yù)后風(fēng)險也出現(xiàn)升高[10]。本研究顯示APACHEⅡ<4分，SOFA<2分的CT比例高于CC與TT基因型，降鈣素原減少比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;28 天死亡人數(shù)比例TT低于CC基因型與CT基因型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其余各SNP的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示基因多態(tài)性對預(yù)后有一定的差異性影響。本研究結(jié)果還提示不同T淋巴細(xì)胞凋亡比例膿毒血癥患者M(jìn)THFR C677T基因型分布之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此基因型類別不能用于評估T淋巴細(xì)胞凋亡的情況。

綜上所述，MTHFR C677T的基因多態(tài)性可能影響膿毒血癥患者預(yù)后效果，根據(jù)MTHFR C677T的基因多態(tài)性有助于預(yù)測膿毒血癥的預(yù)后。此外還可參照基因多態(tài)性對疾病進(jìn)一步的分析，指導(dǎo)膿毒血癥的治療。本研究的初步結(jié)論還需要得到進(jìn)一步樣本量的擴(kuò)大與驗證探討。

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收稿日期：2019-8-24;修回日期：2019-9-18

編輯/肖婷婷