王秦 張家佳 劉成桂

摘要：目的 ?建立高表達(dá)IL-12的卵巢癌細(xì)胞，為后續(xù)IL-12治療卵巢癌奠定基礎(chǔ)。方法 ?將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3分為SKOV3組、SKOV3/GFP組和SKOV3/IL-12組三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，SKOV3組不做任何處理，SKOV3/GFP組給予空載病毒感染SKOV3細(xì)胞，SKOV3/IL-12組給予IL-12基因腺病毒感染SKOV3細(xì)胞。腺病毒感染SKOV3細(xì)胞48 h后，使用熒光顯微鏡檢測三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的感染效率，RT-PCR檢測各組SKOV3細(xì)胞IL-12 p35、p40 mRNA水平的表達(dá)量，ELISA方法檢測感染72 h后各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12的含量。結(jié)果 ?SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12組中的SKOV3細(xì)胞均可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，而SKOV3組沒有觀察到綠色熒光，SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12組的感染效率分別是（97±1）%和（95±1）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;RT-PCR結(jié)果表明，與SKOV3和SKOV3/GFP組相比較，SKOV3/IL-12組可以成功擴(kuò)增出IL-12 p35、p40亞基，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;ELISA結(jié)果表明，與SKOV3和SKOV3/GFP組比較，SKOV3/IL-12組能夠高表達(dá)IL-12P70蛋白，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?成功建立了高表達(dá)IL-12的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，為進(jìn)一步采用IL-12進(jìn)行卵巢癌的免疫治療打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：IL-12;卵巢癌;高表達(dá);SKOV3細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R737.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.024

文章編號(hào)：1006-1959（2019）21-0078-04

Abstract：Objective ?To establish ovarian cancer cells with high expression of IL-12， and lay a foundation for the subsequent treatment of ovarian cancer with IL-12. Methods ?The human ovarian cancer cell line SKOV3 was divided into three groups： SKOV3 group， SKOV3/GFP group and SKOV3/IL-12 group. SKOV3 group was not treated. SKOV3/GFP group was given virus-infected SKOV3 cells，The SKOV3/IL-12 group was administered with IL-12 gene adenovirus to infect SKOV3 cells. After infection with SKOV3 cells for 48 h， the infection efficiency of the three experimental groups was detected by fluorescence microscopy. The expression levels of IL-12 p35 and p40 mRNA in SKOV3 cells were detected by RT-PCR. ELISA method was used to detect the content of IL-12 in the culture medium of each group 72 h after infection.Results ?The SKOV3 cells in the SKOV3/GFP and SKOV3/IL-12 groups were observed to have green fluorescence under the fluorescence microscope， while the green fluorescence was not observed in the SKOV3 group， and the infection efficiencies in the SKOV3/GFP and SKOV3/IL-12 groups were （ 97±1）% and （95±1）%， the difference was statistically significant （P<0.05）;RT-PCR results showed that compared with SKOV3 and SKOV3/GFP group， ILOV p35 and p40 subunits could be successfully amplified in SKOV3/IL-12 group， the difference was statistically significant （P<0.05）; ELISA results showed Compared with SKOV3 and SKOV3/GFP group， SKOV3/IL-12 group can express IL-12P70 protein with high expression，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?The ovarian cancer SKOV3 cells with high expression of IL-12 have been successfully established， which lays a foundation for further immunotherapy of ovarian cancer with IL-12.

Key words：IL-12;Ovarian cancer;High expression;SKOV3 cells

卵巢癌（ovarian carcinoma）是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)最常見的婦科腫瘤之一，它是第5位致死性女性惡性腫瘤[1]，美國每年大約有14000人因卵巢癌死亡，并且有近22000名婦女被新確診為卵巢癌[2]。由于其處于腹部深處早期不易發(fā)現(xiàn)，而且腫瘤細(xì)胞容易脫落通過腹腔液向其他盆腔和腹膜器官擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，所以卵巢癌的治療效果不佳，5年總生存率約為46.5%[3]。卵巢癌的主要治療手段是手術(shù)以及紫杉醇和鉑類藥物等的聯(lián)合化療，雖然大部分患者在早期進(jìn)行積極的一線治療后可以得到完全的臨床緩解，但是隨著化療藥物耐藥性的增加，越來越多的患者在復(fù)發(fā)后將難以治愈，也缺乏更有效的治療手段，近年來國內(nèi)外研究者一直致力于靶向藥物免疫療法來治療腫瘤，這一療法為復(fù)發(fā)性卵巢癌的治療帶來了新的曙光[4]。白細(xì)胞介素12（IL-12）是人體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，它主要由抗原遞呈細(xì)胞分泌并參與免疫調(diào)節(jié)過程，具有抗腫瘤抗炎的作用，也廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療之中[5]，本實(shí)驗(yàn)擬建立高表達(dá)IL-12的卵巢癌細(xì)胞株模型，觀察IL-12在卵巢癌細(xì)胞株中是否能高表達(dá)，為后續(xù)IL-12治療卵巢癌奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料 ?實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存的攜綠色熒光蛋白的空載病毒載體pAd5F35-GFP和重組人IL-12腺病毒載體pAd5F35-IL-12[6]，實(shí)驗(yàn)室前期保存的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640購自Gibco公司，磷酸鹽緩沖液PBS購自博士德公司，總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及DNA Maker均購自TaKaRa公司，大連寶生物技術(shù)公司合成實(shí)驗(yàn)所需引物（IL-12 p35、p40和β-actin），ELISA試劑盒（檢測人IL-12 p70蛋白）購自R&D公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 ?在生物安全柜中復(fù)蘇凍存的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，用已配好的細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液）培養(yǎng)，全程無菌操作，然后將細(xì)胞放置于37℃含5% CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后觀察SKOV3細(xì)胞生長的情況并更換培養(yǎng)液，此后細(xì)胞每天換液，隔天傳代1次，然后選用對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3分為SKOV3組、SKOV3/GFP組和SKOV3/IL-12組三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，SKOV3組不做任何處理，SKOV3/GFP組給予空載病毒感染SKOV3細(xì)胞，SKOV3/IL-12組給予IL-12基因腺病毒感染SKOV3細(xì)胞。

1.2.2重組人IL-12腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 ?離心收集前期培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，然后三組中分別加入1×106個(gè)卵巢癌細(xì)胞，其中SKOV3組不做處理，SKOV3/GFP和SKOV3/IL-12組分別加入相應(yīng)感染復(fù)數(shù)為100并帶有綠色熒光蛋白的腺病毒，處理48 h后使用顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞的形態(tài)和熒光表達(dá)情況，并采集三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞圖片。

1.2.3 RT-PCR測定各組SKOV3細(xì)胞IL-12 p35、p40 mRNA水平的表達(dá)量 ?按照1.2.2的操作收集病毒感染48 h后的三組SKOV3細(xì)胞，先使用總RNA提取試劑Trizol提取SKOV3細(xì)胞的總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為反應(yīng)模板在PCR儀上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增內(nèi)參基因β-actin、IL-12 p35、p40基因，擴(kuò)增基因時(shí)先在GeneBank中查找β-actin、IL-12 p35、p40的基因序列，分別是NM_001101.3，NM_000882.3和NM_002187.2，然后根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物，見表1。擴(kuò)增反應(yīng)完成后立即將產(chǎn)物收集起來進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用的是濃度為2.5%的凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件是180 V電泳15 min，電泳完成后在凝膠成像儀下觀察三組基因的擴(kuò)增情況并拍照，采用Quantity One軟件對(duì)電泳的條帶進(jìn)行分析。

1.2.4 ELISA方法檢測卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12的含量 ?按照1.2.2的操作收集病毒感染72 h后的三組SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)液，10000 r/min離心5 min后使用無菌吸管吸取上清液，低溫保存?zhèn)錂z，然后根據(jù)IL-12 ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12 p70蛋白的檢測，最終通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法計(jì)算出三個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中IL-12 p70蛋白的具體含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用（x±s）表示，行單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 IL-12腺病毒感染SKOV3細(xì)胞的感染效率 ?熒光顯微鏡下觀察到SKOV3/GFP組和SKOV3/IL-12組中的SKOV3細(xì)胞均可以發(fā)出綠色熒光，而SKOV3組不能發(fā)出綠色熒光;SKOV3組，SKOV3/GFP組和SKOV3/IL-12組的感染效率分別是0%、（97±1）%、（95±1）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測IL-12 p35、p40 mRNA水平 ?重組IL-12腺病毒感染SKOV3細(xì)胞48 h后逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測到：與SKOV3組和SKOV3/GFP組相比較，SKOV3/IL-12組可以觀察到擴(kuò)增出的155 bp的IL-12 p35條帶和148bp的IL-12 p40條帶，而其他兩組均未檢測到相應(yīng)亞基的條帶，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。這表明IL-12腺病毒可以 成功感染SKOV3細(xì)胞并在mRNA水平表達(dá)IL-12基因。