董玉蘭 謝超 徐冉

摘要：目的 ?探討γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 ?選取2017年7月～2019年6月在景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院就診的100例疑似結(jié)核感染患者和50例健康體檢者作為研究對(duì)象，分別行γ-干擾素釋放試驗(yàn)和涂片抗酸染色鏡檢。將最終確診為結(jié)核病患者48例設(shè)為結(jié)核病組，52例非結(jié)核病患者作為非結(jié)核病組，50例健康體檢者設(shè)為正常對(duì)照組。分析三組TB-IGRAs陽(yáng)性率，對(duì)比肺結(jié)核病組涂陰與涂陽(yáng)TB-IGRAs檢測(cè)結(jié)果，并比較TB-IGRAs與涂片抗酸染色對(duì)結(jié)核病的診斷效能。結(jié)果 ?結(jié)核病組IGRAs陽(yáng)性率高于非結(jié)核病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;涂陽(yáng)肺結(jié)核和涂陰肺結(jié)核患者的IGRAs陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;IGRAs法敏感度為85.42%，特異性為89.22%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為78.85%，陰性預(yù)測(cè)值為92.86%;涂片抗酸染色法敏感度為22.92%，特異性為100.00%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%，陰性預(yù)測(cè)值為73.38%; IGRAs診斷結(jié)核病的敏感度高于涂片抗酸染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?IGRAs具有較高的敏感度和陰性預(yù)測(cè)值，對(duì)結(jié)核病的診斷具有較高的診斷價(jià)值，值得在臨床中應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：γ-干擾素釋放試驗(yàn);結(jié)核病;涂片抗酸染色

中圖分類號(hào)：R446.6;R378.91 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.021

文章編號(hào)：1006-1959（2019）21-0066-03

Abstract：Objective ?To investigate the value of Interferon-Gamma Release Assays （IGRAs） in the diagnosis of tuberculosis. Methods ?A total of 100 suspected tuberculosis patients and 50 healthy subjects from the First People's Hospital of Jingdezhen City from July 2017 to June 2019 were enrolled as Interferon-Gamma Release Assays and smear acid-fast staining. Microscopic examination. Forty-eight patients with tuberculosis were diagnosed as tuberculosis， 52 patients with non-tuberculosis as non-tuberculosis group， and 50 healthy subjects were set as normal control group. The positive rates of three groups of TB-IGRAs were analyzed. The results of TB-IGRAs test of smear and smear were compared with tuberculosis group， and the diagnostic efficacy of TB-IGRAs and smear acid-fast staining for tuberculosis was compared. Results ?The positive rate of IGRAs in the tuberculosis group was higher than that in the non-tuberculosis group and the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the positive rate of IGRAs between smear-positive pulmonary tuberculosis and smear-negative tuberculosis （P>0.05）. The sensitivity of IGRAs method was 85.42%， and the specificity was 89.22%. The predicted value is 78.85%， the negative predictive value is 92.86%; the sensitivity of smear acid-fast staining is 22.92%， the specificity is 100.00%， the positive predictive value is 100.00%， and the negative predictive value is 73.38%; IGRAs is sensitive to the diagnosis of tuberculosis The degree was higher than the smear-resistant acid staining，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?IGRAs have high sensitivity and negative predictive value， and have high diagnostic value for the diagnosis of tuberculosis. It is worthy of clinical application.

Key words：Interferon-Gamma Release Assays;Tuberculosis;Smear acid-fast staining

結(jié)核?。╰uberculosis）屬于一種由結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染性疾病，由于人口密度的上升，致使該病在人群中的發(fā)病率極高，嚴(yán)重威脅了人類健康[1]。據(jù)2010年我國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查估計(jì)，結(jié)核病年發(fā)病例100萬(wàn)，發(fā)病率78/10萬(wàn)。通過(guò)加強(qiáng)結(jié)核病防治工作和落實(shí)結(jié)核病控制措施，近十余年來(lái)我國(guó)的結(jié)核病疫情呈下降趨勢(shì)，但我國(guó)原結(jié)核病疫情比較嚴(yán)重，各地區(qū)差異大，結(jié)核病防控工作任重而道遠(yuǎn)[2]。如何快速發(fā)現(xiàn)患者的癥狀變化及準(zhǔn)確診斷結(jié)核桿菌感染情況是提高結(jié)核病治愈率的關(guān)鍵。既往臨床上多采用微生物監(jiān)測(cè)（細(xì)菌痰培養(yǎng)、痰涂片）、影像學(xué)監(jiān)測(cè)（胸X線、肺CT）、分子生物學(xué)檢查（PCR技術(shù)）、結(jié)核菌素試驗(yàn)（舊結(jié)核菌素或純化蛋白衍生物皮試）等常規(guī)操作診斷結(jié)核病，雖然對(duì)病情起到了一定的控制作用，但仍存在敏感性低、診斷效果不理想等諸多不足。因此，開(kāi)發(fā)特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的結(jié)核桿菌感染的診斷方法已經(jīng)成為全球共識(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌在特異性抗原的刺激下能釋放出γ-干擾素，故臨床上可用γ-干擾素水平來(lái)間接判斷是否感染結(jié)核病即γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）。因此，本研究選取了100例疑似結(jié)核感染患者通過(guò)回顧性分析以評(píng)價(jià)IGRAs在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 ?選取2017年7月～2019年6月在景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院收治的100例疑似結(jié)核感染患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。根據(jù)患者的臨床癥狀，結(jié)合影像學(xué)、病理學(xué)檢查、結(jié)核治療有效性觀察及《臨床診療指南-結(jié)核病分冊(cè)》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[3]，將最終確診48例結(jié)核病患者設(shè)為結(jié)核病組，其中男34例，女14例，年齡16～89歲，平均年齡（57.15±16.33）歲;非結(jié)核病患者52例設(shè)為非結(jié)核病組，其中男37例，女15例，年齡15～90歲，平均年齡（55.02±19.47）歲。另外選取該院體檢中心50例健康體檢者設(shè)為正常對(duì)照組。其中男35例，女15例，年齡18～85歲，平均年齡（53.20±16.19）歲。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) ?納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷明確，病歷資料完善者;②健康體檢者胸部X線及各項(xiàng)生理指標(biāo)和身體機(jī)能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①HIV陽(yáng)性患者;②接受放、化療以及免疫抑制藥物治療患者和合并糖尿病患者。

1.3儀器與試劑 ?IGRAs檢測(cè)試劑購(gòu)于武漢海吉力生物科技有限公司。免疫酶標(biāo)分析儀為美國(guó)伯爵儀器有限公司（Bio Tek Instruments Inc） ELX800，洗板機(jī)為美國(guó)伯爵儀器有限公司ELX405?？顾崛旧珯C(jī)為珠海貝索生物技術(shù)有限公司AUTO STAINER BSZ-GT116。顯微鏡為美國(guó)OLYMPUS CX21FS1。生物安全柜為濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司BSC-1100ⅡA2-X。

1.4方法

1.4.1全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)（TB-IGRAs） ?三組患者均于清晨空腹采用肝素抗凝采血管（美國(guó)BD制造）采集不少于4 ml的全血，打開(kāi)生物安全柜的紫外燈照射15～20 min，3 h內(nèi)將全血送至檢驗(yàn)科，將采集的抗凝全血顛倒混勻20次，每次吸取1 ml分別分裝至“N” （陰性對(duì)照）、“T” （檢測(cè)）、“P”（陽(yáng)性對(duì)照）3個(gè)培養(yǎng)管中。于37℃水浴箱中培養(yǎng)20～24 h后，3000～5000 r/min下離心10 min，小心吸取上清液于1.5 ml標(biāo)記好的離心管中用于IFN-γ含量檢測(cè)。IFN-γ含量的檢測(cè)使用酶標(biāo)儀法。酶標(biāo)板中每個(gè)目標(biāo)孔加入50 μl稀釋液，然后再加入上述3個(gè)不同管上清液各50 μl，輕微振蕩混勻，同時(shí)各取 ? 100 μl按要求配置好的梯度校準(zhǔn)品（6個(gè)濃度，每個(gè)濃度做2孔）按順序加入板孔中，封板，置37℃溫箱1 h;洗板，加入50 μl生物素抗體，封板，37℃溫箱中溫育30 min;洗板，每孔加入100 μl稀釋后酶復(fù)合物（按稀釋液：酶復(fù)合物=99∶1比例），37℃溫箱中避光溫育30 min;洗板，加入A、B顯色劑各50 μl，充分混勻，置黑暗條件下反應(yīng)15 min后加入50 μl反應(yīng)終止液，立即用美國(guó)伯爵免疫酶標(biāo)分析儀讀取450 nm處的OD值（以630 nm為參考）。然后將N、P、T讀取的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到N、P、T三個(gè)濃度值（IU/ml）。結(jié)果判讀：T-N（IU/ml）≥0.35，且≥N/4判斷為陽(yáng)性 。

1.4.2涂片抗酸染色鏡檢 ?三組患者均于清晨使用生理鹽水漱口，咳痰，取帶血或粘稠膿性的痰液;或非呼吸道樣本（如腦脊液、胸腔、盆腔積液、尿液等），連續(xù)3 d送檢。嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)操作規(guī)程，觀察油鏡下的狀態(tài)，若檢見(jiàn)抗酸桿菌，則結(jié)果為陽(yáng)性，若未見(jiàn)抗酸桿菌，則結(jié)果為陰性。具體操作方法為：新鮮干凈玻片涂樣→自然干燥→固定→石碳酸復(fù)紅溶液加熱染色5 min→水洗→3%鹽酸乙醇脫色→水洗→亞甲藍(lán)溶液復(fù)染1 min→水洗后干燥鏡檢，保持復(fù)紅顏色為抗酸性細(xì)菌，藍(lán)色為非抗酸性細(xì)菌。結(jié)果判斷：油鏡下所見(jiàn)抗酸菌數(shù)量為0，則報(bào)告陰性-;1～9個(gè)/100個(gè)視野，則報(bào)告1+;1～9個(gè)/10個(gè)視野，則報(bào)告2+;1～9個(gè)/個(gè)視野，則報(bào)告3+;>9個(gè)/個(gè)視野，則報(bào)告4+。

1.5評(píng)價(jià)指標(biāo) ?分析三組TB-IGRAs檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比涂陽(yáng)肺結(jié)核和涂陰肺結(jié)核患者的TB-IGRAs陽(yáng)性率，并分析TB-IGRAs與涂片抗酸染色對(duì)結(jié)核病的診斷效能。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。計(jì)量資料使用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料使用（n，%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組TB-IGRAs陽(yáng)性率比較 ?結(jié)核病組TB-IGRAs陽(yáng)性率高于非結(jié)核病組和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2肺結(jié)核病組涂陰與涂陽(yáng)TB-IGRAs檢測(cè)結(jié)果比較 ?涂陽(yáng)肺結(jié)核和涂陰肺結(jié)核患者的TB-IGRAs陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3 TB-IGRAs與涂片抗酸染色對(duì)結(jié)核病的診斷結(jié)果比較 ?TB-IGRAs診斷結(jié)核病的敏感度為85.42%（41/48），高于涂片抗酸染色的22.92%（11/48）（P<0.05）;TB-IGRAs診斷結(jié)核病的特異性為89.22%（91/102），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為78.85%（41/52），陰性預(yù)測(cè)值為92.86%（91/98），涂片抗酸染色診斷結(jié)核病的特異性為100.00%（102/102），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%（11/11），73.38%（102/139），見(jiàn)表3。

3討論

結(jié)核患者的細(xì)菌學(xué)檢查是臨床上常用的診斷方式，不僅可以作為制定治療方案的標(biāo)準(zhǔn)，也是評(píng)價(jià)治療有效程度的重要依據(jù)[4]。細(xì)菌學(xué)檢查可分為直接鏡檢法和分離培養(yǎng)法，直接鏡檢法具有快速、方便有效的特點(diǎn)。但細(xì)菌學(xué)檢查還存在一些缺點(diǎn)，如檢查過(guò)程中可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，涂片陽(yáng)性并非一定為結(jié)核分枝桿菌。鏡檢水平及實(shí)驗(yàn)室條件的參差不齊、標(biāo)本中結(jié)核桿菌濃度必須大于5000條/ml、L-型結(jié)核桿菌對(duì)抗酸染色敏感度差導(dǎo)致結(jié)果有可能出現(xiàn)假陰性等，都會(huì)影響檢查的準(zhǔn)確性[5，6]。此外，該方法對(duì)結(jié)核病變部位在肺外的及菌陰性肺結(jié)核的診斷難度加大，造成癥狀加重，增加死亡率。影像學(xué)檢查也是診斷結(jié)核病的常用手段，但當(dāng)感染MTB患者癥狀不典型，病灶不明顯時(shí)，影像學(xué)檢查就無(wú)法做出準(zhǔn)確診斷。結(jié)核病具有癥狀模糊、病情反復(fù)等特點(diǎn)，臨床上常造成漏診、誤診，不僅對(duì)患者身心造成傷害，也加重了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，如何準(zhǔn)確、快速的診斷結(jié)核病是近年來(lái)廣泛醫(yī)護(hù)人員關(guān)心的熱點(diǎn) 話題。

1996年有學(xué)者在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)一段特殊的基因序列，該序列不存在于卡介苗菌株（BCG）和大部分非結(jié)核分枝桿菌（NTM）中[7]。當(dāng)機(jī)體初次感染MTB時(shí)，T淋巴細(xì)胞會(huì)迅速過(guò)敏，當(dāng)MTB再次入侵，特異性抗原ESAT-6和CFP-10會(huì)刺激活化的T細(xì)胞生成釋放γ-干擾素，因此，通過(guò)測(cè)定是否有γ-干擾素的存在可作為評(píng)價(jià)機(jī)體是否感染結(jié)核病的一種方法。IGRAs法靈敏度高，且不受卡介苗和大部分非致病分枝桿菌的影響在診斷結(jié)核病中脫穎而出。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核病組TB-IGRAs陽(yáng)性率（85.42%）高于非結(jié)核病組（15.38%）和正常對(duì)照組（6.00%），與國(guó)內(nèi)[8-11]和國(guó)外[12]的研究數(shù)據(jù)相符。而IGRAs對(duì)涂陽(yáng)和涂陰肺結(jié)核患者的診斷陽(yáng)性率分別為88.00%、81.82%，兩組間對(duì)比無(wú)明顯差異，也凸顯了IGRAs在菌陰性肺結(jié)核患者的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。機(jī)體T細(xì)胞具有結(jié)核桿菌刺激記憶性，除完全治愈的患者外，IGRAs檢測(cè)在潛伏及發(fā)病結(jié)核病患者中均呈陽(yáng)性[13]。

本研究通過(guò)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照能夠更準(zhǔn)確、客觀的評(píng)價(jià)受試者是否患病。相較于細(xì)菌學(xué)檢查的周期長(zhǎng)、敏感性低的特點(diǎn)，IGRAs在卡介苗覆蓋率廣的地方及菌陰性結(jié)核、肺外結(jié)核的應(yīng)用影響更為深遠(yuǎn)[14]。本研究中，IGRAs法敏感度為85.42%，陰性預(yù)測(cè)值為92.86%，IGRAs診斷結(jié)核病的敏感性和陰性預(yù)測(cè)值均高于涂片抗酸染色，說(shuō)明在我國(guó)高結(jié)核感染率的背景下，陰性結(jié)果對(duì)于排除結(jié)核病的診斷具有重要意義。但特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低于涂片抗酸染色，因此在兩者結(jié)果不相符的情況下，還需根據(jù)患者臨床癥狀和其他實(shí)驗(yàn)室檢查綜合做出判斷。有研究指出，在MTB的刺激下效應(yīng)T細(xì)胞會(huì)大量聚集在病變部位（即腦脊液、胸腔積液、肺囊腫液等）釋放γ-干擾素，即病變部位取樣的IGRAs診斷結(jié)果會(huì)更優(yōu)，但本研究取樣部位為全血，還待將來(lái)以病變部位樣本做進(jìn)一步的研究。

綜上所述， IGRAs陰性結(jié)果對(duì)于排除結(jié)核桿菌感染的價(jià)值更大，陽(yáng)性結(jié)果對(duì)于菌陰性肺結(jié)核具有重要的輔助診斷價(jià)值，值得在臨床中應(yīng)用。

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收稿日期：2019-8-10;修回日期：2019-8-25

編輯/肖婷婷