何秀梅，藏志煥，陳 晴，趙瑛博*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

圓椒，又名川菜椒（Capsicum annuum var.grossum），俗稱燈籠椒、柿子椒，是茄科辣椒屬辣椒的一個(gè)變種。圓椒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中屬于大宗蔬菜品種，在我國(guó)的生產(chǎn)和消費(fèi)量都十分巨大[1]。對(duì)于圓椒的貯藏保鮮方法通常是低溫貯藏，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的降低，圓椒會(huì)出現(xiàn)一系列的冷害現(xiàn)象[2-3]，例如表皮全部或局部出現(xiàn)水漬樣凹陷斑，表皮顏色轉(zhuǎn)為深綠，進(jìn)而腐爛，完全失去商品屬性。研究表明，這些冷害現(xiàn)象的出現(xiàn)與細(xì)胞膜脂代謝紊亂有重大關(guān)聯(lián)。在發(fā)生冷害時(shí)，細(xì)胞膜由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，膜間隙變大，流動(dòng)性降低，透性升高，而影響到細(xì)胞膜功能。膜脂的種類、含量以及不飽和度的高低影響著膜脂的相變，其中含量最高的是磷脂，其他還有糖脂、甘油脂等，這些脂類在各代謝網(wǎng)絡(luò)中可以相互轉(zhuǎn)化，彼此關(guān)聯(lián)[4]。因此，監(jiān)測(cè)冷藏過(guò)程中圓椒細(xì)胞膜磷脂種類和含量的變化對(duì)于評(píng)估圓椒冷害發(fā)生的程度以及提出調(diào)控冷害發(fā)生的有效方法具有重要意義。

甘油磷脂是最重要的磷脂，是親水脂兩性分子。甘油主鏈的第3個(gè)羥基被磷酸酯化，磷酸基團(tuán)又與各種結(jié)構(gòu)不同的小分子化合物相連接，而具有極性，成為極性頭部。另外2 個(gè)羥基被脂肪酸酯化，具有非極性特性，成為非極性尾部。根據(jù)磷酸基連接的小分子種類的不同，甘油磷脂可以分為磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylamide ethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidyl amide serine，PS）、磷脂酰甘油酸（phosphatidyl amide glycerol，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）及磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等；如果甘油主鏈sn-2位未被取代，則得到溶血磷脂，包括溶血磷脂膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂乙醇胺（lysophosphatidylamide ethanolamine，LPE）、溶血磷脂絲氨酸（lysophosphatidyl amide serine，LPS）、溶血磷脂甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、溶血磷脂肌醇（lysophosphatidylinositol，LPI）、溶血磷脂酸（lysophosphatidyl amide glycerol，LPA）等[5-6]。在每一類磷脂中又可因組成的脂肪酸不同而有若干種，因此甘油磷脂的種類繁多。這為磷脂分子的定性定量分析帶來(lái)一定困難，因此需要采用可靠的手段確認(rèn)磷脂的種類，并采用相對(duì)定量的方法為每種磷脂定量。

磷脂成分的分離和鑒別有多種方法，例如液相色譜-蒸發(fā)光散射、電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9]（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）等。在這些方法中，由于具有更高的柱效和更強(qiáng)的定性能力，UPLCMS/MS法可以使磷脂獲得更佳的分離并能夠方便的對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。分離的方式有正相分離和反相分離[10]，正相分離采用的流動(dòng)相極性較低，與質(zhì)譜的兼容性較差；磷脂在反相C8柱[11]或C18柱[12-13]的分離主要依靠支鏈碳數(shù)的差別，而在不同極性頭部磷脂間的分離則較弱。近年來(lái)開發(fā)的HILIC色譜柱采用了極性改性的固定相，而增強(qiáng)了對(duì)強(qiáng)極性化合物的保留能力，Ma Xiaoxiao[14]和Ali[15]等使用HILIC色譜體系對(duì)磷脂成分進(jìn)行分離，獲得了較傳統(tǒng)正相、反相系統(tǒng)更好的分離效果。在串聯(lián)質(zhì)譜法中應(yīng)用于磷脂鑒別的主要為三重四極桿質(zhì)譜[16-17]和四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜[12,15,18-22]兩種。前者可以通過(guò)母離子掃描和中性丟失掃描等方式確定特征碎片，而后者則是通過(guò)測(cè)量精確分子質(zhì)量和特征碎片對(duì)磷脂分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

關(guān)于細(xì)胞膜磷脂的樣品來(lái)源，既有植物樣品也有動(dòng)物樣品。動(dòng)物源樣品包括組織[16,23-24]、血漿[11,18,25]、蛋類、奶等[15]；植物樣品包括蔬菜[22]、水果、葉片、模式植物擬南芥等[26]。相對(duì)于動(dòng)物樣品，由于含有細(xì)胞壁，所以植物來(lái)源的磷脂成分的提取過(guò)程相對(duì)繁瑣。液液萃取法通常用于動(dòng)植物樣品中磷脂的提取，采用的溶劑主要為甲醇-氯仿[11,12,27]以及甲醇[19-20]、異丙醇等。另外，Karin等[17]也采用固相萃取法提取磷脂。本實(shí)驗(yàn)將分別采取以上各方法分別提取圓椒中磷脂，并對(duì)提取出的磷脂種類和含量進(jìn)行比較和評(píng)估，以優(yōu)化提取方法。

本研究分別討論以甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑的液液萃取方法以及固相萃取法提取圓椒中的磷脂，通過(guò)比較各方法測(cè)出的磷脂種類和含量評(píng)估最優(yōu)前處理方法。采用HILIC系統(tǒng)分離不同種類的磷脂，以三重四極桿質(zhì)譜法鑒別其結(jié)構(gòu)并用相對(duì)定量法定量。同時(shí)對(duì)方法的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而建立針對(duì)圓椒樣品磷脂測(cè)定的UPLC-MS/MS方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圓椒購(gòu)自沈陽(yáng)市當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。樣品新鮮無(wú)機(jī)械損傷。取果肉部分切成0.5 cm×1.0 cm的小塊，備用。

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：PA（C28:0）、LPS（C16:0）、LPC（C14:0）、LPE（C14:0） 美國(guó)Avanti Polar Lipids公司；PG（C28:0）、PC（C28:0） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

甲醇、乙腈、甲酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Scientific公司。用于樣品制備的其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A型液相色譜系統(tǒng)、LCMS-8050型LC-MS聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 日本島津公司；ACQUITY UPLC?BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Sep-Pak硅膠固相萃取柱（500 mg） 美國(guó)Waters公司；902超低溫冰箱（-80 ℃） 美國(guó)Thermo公司；CR21N低溫高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；Cenco渦旋儀 荷蘭Breda公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

為選擇適合圓椒樣品的磷脂提取方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)5 種經(jīng)典的磷脂提取方法進(jìn)行修改，并分別應(yīng)用于圓椒磷脂的提取。為了表述方便，將這些方法依次命名為甲醇法、異丙醇法、異丙醇-氯仿-水法、BD（Bligh and Dyer）法和固相萃取法。具體的前處理過(guò)程如下：

甲醇法：稱取約3 g樣品，加入3 mL甲醇，渦旋1 min，離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm濾膜。

異丙醇法：稱取約3 g青椒樣品，加入3 mL異丙醇，渦旋1 min，離心。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸至近干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm濾膜。

異丙醇-氯仿-水法：取3 g青椒樣品，迅速置于75 ℃預(yù)熱的3 mL異丙醇（含0.01%二丁基羥基甲苯（dibutylhydroxytoluene，BHT））中浸泡15 min，然后加入1.5 mL氯仿和0.6 mL超純水，搖床中150×g避光振搖1 h。提取液轉(zhuǎn)移到50 mL玻璃管中。殘?jiān)儆? mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V，含0.01% BHT）溶液抽提5 次，每次用搖床振搖30 min，直到樣品變白。合并所有提取液，然后分別用1 mL 1 mol/L的KCl溶液和2 mL超純水洗滌提取液。取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解，濾膜過(guò)濾。

BD法：取3 g樣品置于30 mL玻璃管中，加入2 mL甲醇（含0.01% BHT）和4 mL氯仿，超聲60 s后渦旋30 s，室溫下靜置10 h。向提取液中加入2 mL超純水，4 ℃、2 600×g離心10 min。移除上層與中層溶液，底層溶液加入3 mL氯仿，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜。

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法：取3 g樣品，加入2.5 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液及12.5 mL 1 mol/L的NaCl溶液，渦旋后靜置分層，棄去上層溶液，下層氯仿層氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)? mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液溶解，得到樣品溶液。以3 mL正己烷活化Waters Sep-Pak硅膠固相萃取柱。上樣，分別加入3 mL正己烷-乙醚（8∶2，V/V）和3 mL正己烷-乙醚（1∶1，V/V）溶液淋洗，再用6 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水（3∶5∶2，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈伞? mL甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm濾膜。

因?yàn)榱字N類眾多，不同來(lái)源樣品中磷脂種類也不盡相同，所以在對(duì)使用的5 種前處理方法進(jìn)行選擇時(shí)，根據(jù)每種方法能夠檢測(cè)到的磷脂種類、相應(yīng)峰的峰面積作為考核指標(biāo)，選擇提取得到磷脂種類多且峰面積大的方法作為最優(yōu)的前處理方法。

1.3.2 UPLC條件

處理后的樣品用配有ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×75 mm，2 μm）的液相色譜系統(tǒng)分離。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的50 mmol/L乙酸銨溶液（pH 3.18），流動(dòng)相B為乙腈。使用梯度程序洗脫：0～6 min，95%～85% B；16 min，60% B；16.01～20 min，95% B，保持3 min；流速300 μL/min，總運(yùn)行時(shí)間20 min。進(jìn)樣量1.0 μL，柱溫40 ℃。

1.3.3 MS條件

電噴霧離子源，干燥氣、霧化氣為氮?dú)猓訜釟鉃榭諝?，干燥氣流?0 L/min，霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量10 L/min。離子源溫度300 ℃，脫溶劑溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃、噴霧電壓±3 000 V。PC、LPE、LPC、LPS在正離子模式下測(cè)定，PA和PG在負(fù)離子模式下測(cè)定。各磷脂測(cè)定參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters in the MRM mode

1.3.4 方法適應(yīng)性

為考察方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。方法的靈敏度用檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）表示。分別測(cè)定質(zhì)量濃度為125 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）基質(zhì)溶液，測(cè)定信噪比，計(jì)算檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。考慮到樣品基質(zhì)中可能含有的磷脂本底情況，添加的磷脂均為基質(zhì)中不含有或含量極少。方法的準(zhǔn)確度和精密度用方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。向3 g樣品中分別添加125、250 ng/mL和375 ng/mL三個(gè)水平的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按上述方法進(jìn)行前處理和UPLC-三重四極桿質(zhì)譜方法測(cè)定。每個(gè)添加水平做6 個(gè)重復(fù)，計(jì)算方法回收率和RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

利用不同種類磷脂極性頭部的特征碎片進(jìn)行中性丟失掃描或母離子掃描可以在一定程度上說(shuō)明各前處理方法提取得到的磷脂種類，進(jìn)而判斷各前處理方法性能的優(yōu)劣。各種類磷脂的特征碎片和掃描方式見表2。

表2 磷脂掃描方式及特征碎片Table 2 Scanning modes and characteristic fragments for phospholipids

利用母離子掃描和中性丟失掃描的方式分別對(duì)5 種前處理方法抽提得到的磷脂進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)到的磷脂數(shù)量和相關(guān)峰面積結(jié)果見表3。

表3 前處理方法的選擇Table 3 Selection of pretreatment methods

在這5 種方法中，異丙醇法和異丙醇-氯仿-水法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較多，但是在相關(guān)峰的峰面積比較中，異丙醇-氯仿-水法比異丙醇法多，且異丙醇法未能測(cè)得PS；其余3 種方法檢測(cè)到的磷脂數(shù)目較少、峰面積較低，BD法未能測(cè)得PI和PE，SPE法未能測(cè)得PI。因此選擇異丙醇-氯仿-水法作為提取磷脂的方法較為合適。

2.2 磷脂組分的分離

在HILIC體系中，流動(dòng)相的pH值對(duì)組分的保留和選擇性的影響相比反相體系更大。因此，在實(shí)驗(yàn)中分別使用pH 3.18、pH 4.45、pH 2.78的流動(dòng)相B分析樣品，最終確定在不同的pH值條件下，各磷脂的峰形、流出時(shí)間均有所不同。綜合考察分離及流出情況，選擇流動(dòng)相B的pH值為3.18。

由于極性頭部的不同，PG、LPI在僅負(fù)離子模式下有響應(yīng)；PC、LPC只在正離子模式下有響應(yīng)；LPS、LPE在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但在負(fù)離子模式下的響應(yīng)更高，因此，PG、LPI、LPE、LPS在負(fù)離子模式下采集，PC、LPC在正離子模式下采集。各磷脂梯度洗脫順序?yàn)镻G＜LPI＜LPE＜PC＜LPC＜LPS。各組分總離子流圖見圖1。

圖1 磷脂組分總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram

2.3 磷脂的裂解規(guī)律

在外界有能量輸入時(shí)，磷脂分子的化學(xué)鍵會(huì)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生若干二級(jí)碎片離子，這些離子反映磷脂分子的結(jié)構(gòu)，因此這些碎片離子也被稱為特征碎片。根據(jù)特征碎片可以判斷與甘油骨架酯化的脂肪酸殘基和極性頭部，從而確認(rèn)磷脂的分子結(jié)構(gòu)。

分別將PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID），使其中的化學(xué)鍵進(jìn)行斷裂和重排，獲得其特征碎片，進(jìn)而解釋其裂解規(guī)律。由于磷脂分子結(jié)構(gòu)的不同，不同種類的磷脂會(huì)分別在正離子模式或負(fù)離子模式下有更好地響應(yīng)，在本實(shí)驗(yàn)中PC、LPC、LPE、LPS在正離子模式下響應(yīng)更高，而PA、PG在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高。

圖2 正離子模式下的PC（A）、LPC（B）、LPE（C）、LPS（D）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 Tandem mass spectra of PC (A), LPC (B), LPE (C), and LPS (D) in the positive ion mode

如圖2A所示，母離子為[M＋H]＋，m/z 678，磷酸酯鍵被打斷后產(chǎn)生PC（[C5H14O4NP＋H]＋）特征離子，m/z 184，該碎片離子為PC和溶血PC類分子的特征離子。其他的離子碎片m/z 495.4對(duì)應(yīng)[M＋H-183]＋，m/z 211.2對(duì)應(yīng)脫水肉豆蔻酸殘基離子；m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-183-211]＋。在二級(jí)質(zhì)譜圖中無(wú)其他脂肪酸殘基碎片，表明在甘油骨架sn-1和sn-2上都與肉豆蔻酸殘基相連。

如圖2B所示，LPC（C14:0）的二級(jí)質(zhì)譜圖與PC的裂解規(guī)律類似。m/z 468為母離子，對(duì)應(yīng)[M＋H]＋，在CID模式下，磷酸酯鍵被打斷，產(chǎn)生PC[C5H14O4NP＋H]＋和[C5H12N＋H]＋，對(duì)應(yīng)m/z 184和m/z 86。m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-183-211]＋。

如圖2C所示，母離子為[M＋H]＋，m/z 426，磷酸酯鍵被打斷后出現(xiàn)PE的特征碎片[C2H7O4NP＋H]＋，m/z 141（未顯示），離子碎片m/z 285.2對(duì)應(yīng)[M＋H-140]＋。m/z 211.2為脫水肉豆蔻酸殘基離子。在丟失肉豆蔻酸殘基后，PE再繼續(xù)裂解，中性丟失乙醇胺部分后的碎片對(duì)應(yīng)為m/z 155.01。

如圖2D所示，m/z 498為母離子[M＋H]＋，m/z 313.2對(duì)應(yīng)LPS（C16:0）甘油骨架上sn-3位上磷酸酯鍵斷裂后產(chǎn)生的碎片，即[M＋H-C3H7O6NP]＋；m/z 239.2對(duì)應(yīng)脫水棕櫚酸殘基；m/z 155.01對(duì)應(yīng)[M＋H-C16H29O-C3H7O3N]＋，即LPS（C16:0）丟失脫水肉豆蔻酸殘基后中性丟失絲氨酸殘基后的碎片。

圖3 負(fù)離子模式下的PA（C28:0）（A）、PG（C28:0）（B）的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 Tandem mass spectra of PA (C28:0) (A) and PG (C28:0) (B)in the negative ion mode

如圖3A所示，m/z 591為PA（C28:0）的母離子[MH]-，m/z 363.2為磷脂酸sn-1位丟失肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片；m/z 381為sn-1位丟失脫水肉豆蔻酸殘基后產(chǎn)生的碎片；m/z 363.2碎片繼續(xù)裂解，丟失sn-2位脫水肉豆蔻酸殘基后得到m/z 153.0離子。圖3A中響應(yīng)值最高的m/z 227.2碎片為脫水肉豆蔻酸殘基。

如圖3B所示，m/z 665.4為PG（C28:0）的母離子[MH]-，m/z 455.2為PG分子丟失sn-1位脫水肉豆蔻酸殘基產(chǎn)生的碎片；m/z 363.2碎片對(duì)應(yīng)為m/z 455.2碎片上sn-3位甘油殘基繼續(xù)裂解丟失得到；然后該碎片上的sn-2位酯鍵繼續(xù)斷裂丟失脫水肉豆蔻酸殘基，得到m/z 153.0碎片。m/z 227.2對(duì)應(yīng)肉豆蔻酸殘基。

通過(guò)對(duì)正、負(fù)離子模式下各類磷脂裂解規(guī)律的分析可以發(fā)現(xiàn)，在受到外界能量輸入時(shí)，甘油骨架sn-3位上的磷酸酯鍵以及sn-1和sn-2位上的酯鍵更容易斷裂，產(chǎn)生磷脂的極性頭部和脂肪酸相關(guān)殘基特征碎片，根據(jù)這些特征碎片可以為磷脂做定性分析。

2.4 方法適應(yīng)性

2.4.1 方法的線性范圍和靈敏度

為了避免基質(zhì)效應(yīng)，以圓椒樣品提取溶液作為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為10、50、100、500、1 000 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)溶液質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各磷脂的LOD和LOQ，結(jié)果見表4。

表4 磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LOD及LOQTable 4 Standard curves, linear ranges, limits of detection and limits of quantification

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

表5 3 個(gè)添加水平的磷脂回收率與RSD（n=8）Table 5 Recoveries of phospholipids at three spiked levels and relative standard deviation (RSD) (n= 8)

由表5可知，6 種磷脂在3 個(gè)添加水平的平均回收率在68.06%～84.17%之間，RSD在3.40%～9.60%之間。參照農(nóng)殘分析實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（LOQ在0.01～0.1 mg/kg時(shí)，回收率在70%～120%之間，變異系數(shù)小于22%；LOQ在0.1～1.0 mg/kg時(shí)，回收率在70%～110%之間，變異系數(shù)小于18%），該方法基本滿足要求。在各種磷脂中PC和LPC在各添加水平中回收率較高，RSD較小，可能是因?yàn)镻C和LPC在質(zhì)譜中的響應(yīng)更高。

2.5 方法的應(yīng)用

由于極性頭部的不同和甘油骨架上酯化的脂肪酸殘基種類眾多，導(dǎo)致磷脂種類數(shù)量十分巨大，市場(chǎng)上的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品種類十分有限且價(jià)格高昂，采用常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法鑒別磷脂分子顯然不現(xiàn)實(shí)，因此在定性過(guò)程中，根據(jù)磷脂的保留時(shí)間和流出順序以及得到的二級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行定性分析；同時(shí)，雖然不同磷脂在質(zhì)譜中的響應(yīng)不同，定量時(shí)也只能采用相對(duì)定量法進(jìn)行。在HILIC體系中，各磷脂的分離主要依靠極性頭部，定量時(shí)，向樣品中分別加入一定量的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其作為對(duì)照為具有相同極性頭部的磷脂定量。同時(shí)將相同類別磷脂做歸一化處理，用以表明各磷脂在同類磷脂中的比例。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)圓椒樣品進(jìn)行測(cè)定，如表6所示。

表6 圓椒中磷脂種類及其相對(duì)含量Table 6 Types and relative contents of phospholipids in bell pepper determined by the developed method

由表6可知，圓椒樣品中含有PC、PG、LPS、LPI、LPC、LPE。其中，共發(fā)現(xiàn)7 種PC、6 種LPE、7 種LPC、6 種LPS、6 種PG、6 種PA，共38 種磷脂。各磷脂的含量在0.95～18.49 μg/kg之間。在各種磷脂種類中，PC（C34:2）在PC中占比最高，達(dá)到31.18%；LPE（C16:0）和LPE（C18:1）在LPE中占比最高，分別達(dá)到28.91%和28.75%；LPC（C16:1）在LPC中占比最高，達(dá)到25.37%；在LPS中LPS（C16:3）占比35.55%，含量最高，是最主要的LPS；在PG中PG（C32:0）占比最高，達(dá)到23.89%；在PA中PA（C34:2）的含量最高，為29.83%。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立一種針對(duì)圓椒中磷脂含量測(cè)定的方法。分別對(duì)采用甲醇、異丙醇、異丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿為提取劑，使用液液萃取或固相萃取為凈化方法的前處理過(guò)程進(jìn)行討論，最終確定異丙醇-氯仿-水法抽提得到的磷脂種類最多、含量最高。方法以PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）為對(duì)照，探討了方法的適應(yīng)性。結(jié)果表明，該方法能夠滿足對(duì)圓椒磷脂含量測(cè)定的要求。