張新娜，潘賽超，張旭冬，張秀杰，張永新，周 昉，張春嬌，黃昆侖,3，馬麗艷,3,*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100045；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

糖苷生物堿是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，主要分布于茄科和百合科的植物體內(nèi)[1]。番茄是茄科番茄屬草本植物，番茄苷和番茄堿是番茄化合物中重要的生物活性因子[2]。番茄苷，又名番茄素或番茄苷，是一種含有D-木糖、D-半乳糖及兩分子葡萄糖的糖苷生物堿[3]，番茄堿是番茄苷水解脫糖后形成的糖苷元，其生物活性比番茄苷低[4-5]。番茄苷能夠保護番茄植株在生長過程中免受細菌、真菌、病毒和某些昆蟲的侵害[6-7]，對很多害蟲都有驅(qū)拒性，是一種天然的植物源殺蟲劑[8-9]。研究表明，番茄苷具有抗炎[10-11]、抗癌功效[12-13]，對乳腺癌[14]、前列腺癌[15]、結(jié)腸癌[16]、肝癌和肺癌[17]等有一定的治療效果。然而，作為一種甾體生物堿，番茄苷會造成小鼠胚胎畸形或顱面畸形等[18-21]，對人的胃腸道也有刺激作用，具有一定的神經(jīng)毒性[22-23]，大量食用后會出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐和乏力等癥狀。

番茄中生物堿的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、免疫測定法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法等。利用HPLC法進行分析時，可采用紫外檢測器、脈沖安培檢測器，示差檢測器等進行測定[24-28]。紫外檢測器易受到其他物質(zhì)的干擾，檢出限高于脈沖安培檢測器。利用GC-MS法進行分析時，不能對番茄苷直接進行測量，而是要先將其水解成相應(yīng)的糖苷并衍生后才能進行測量，增加了操作的復(fù)雜性[4,29]。免疫測定法需要檢測樣品有相當高的純度，Barbour等[30]用免疫測定法測定番茄苷時發(fā)現(xiàn)，該方法對于分析糖苷生物堿呈現(xiàn)的是一種非線性關(guān)系。此外分光光度檢測法[31]、放射配體檢測法[32]也可用于番茄苷的檢測。分光光度檢測法容易受到提取物中雜質(zhì)和有色物的影響，放射配體檢測法不需要對沉淀物進行純化，能夠檢測出溶液中與膽固醇相結(jié)合的番茄苷的含量[33]。HPLC-MS/MS具有高選擇性和靈敏度，在番茄堿的分析中應(yīng)用越來越廣泛，目前對番茄苷的檢測多采用選擇離子監(jiān)測的模式[34-36]，番茄苷和番茄堿同時測定的報道較少。

目前，對番茄中番茄堿的含量測定的報道較少，有研究表明番茄在成熟過程中，番茄苷的含量逐漸降低，正常成熟的番茄中番茄堿的含量較低，一般不會引起中毒[4]。但在番茄生產(chǎn)、銷售過程中，部分生產(chǎn)者為了方便運輸，會提前采收，利用藥物對番茄進行催熟，尤其是在反季節(jié)上市的番茄，這種現(xiàn)象更為普遍。為監(jiān)測番茄中番茄堿的含量水平，保護消費者身體健康，迫切需要建立番茄中番茄苷和番茄堿的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均色譜純），冰乙酸、乙酸銨（均為分析純），番茄堿（C27H45NO2，CAS號：77-59-8，純度98%）、番茄苷（C50H83NO21，CAS號：17406-45-0，純度98%） 北京百靈威科技有限公司；C18固相萃取柱（500 mg，6 mL） 安捷倫科技（中國）有限公司；超純水由Millpore純水儀制備。

1.2 儀器與設(shè)備

6460型HPLC-MS/MS儀、固相萃取裝置 美國安捷倫科技有限公司；IKA T25高速勻漿機 北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；YP5002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；HC-3018離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

番茄采自北京昌平蔬菜生產(chǎn)基地，樣品制成勻漿后，-18 ℃冰箱保存。

1.3.2 提取

稱取番茄樣品5.00 g置于燒杯中，加入10%乙酸溶液20.0 mL，勻漿提取2 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r/min離心5 min，上清液用提取液定容至25 mL，待凈化。

1.3.3 凈化

采用C18固相萃取柱凈化。先用5 mL甲醇活化，5 mL 10%乙酸溶液平衡，準確吸取5 mL上清液上柱，5 mL 15%甲醇溶液淋洗，抽干2 min，用5 mL含1%甲酸的90%甲醇溶液洗脫。洗脫液用水稀釋1 倍后過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：Proshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量3 μL；流動相A為5 mmol/L乙酸銨（含0.05%甲酸）溶液；流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：30% B保持2 min，5 min后變?yōu)?0% B，6 min后變?yōu)?0% A，保持7 min。

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，正模式；毛細管電壓3 500 V；干燥氣流速10 mL/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化器壓力35 psi；鞘氣溫度400 ℃；鞘氣流速11 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別在正、負離子模式下對番茄堿和番茄苷標準溶液進行母離子掃描，設(shè)置掃描范圍在300～1 200 u之間，結(jié)果表明2 種化合物均在正離子模式下響應(yīng)較高。確定母離子和掃描模式后，對鞘氣溫度、干燥氣溫度、碎裂電壓、子離子及碰撞能量進行優(yōu)化。結(jié)果表明干燥氣溫度對2 種化合物的響應(yīng)無明顯影響，而隨著鞘氣溫度的升高，番茄苷的響應(yīng)有明顯的提高。通過優(yōu)化，方法設(shè)置干燥氣溫度為350 ℃，鞘氣溫度為400 ℃。

番茄苷的相對分子質(zhì)量為1 033，相對較大，雖然采用離子掃描的方式能對番茄苷的含量進行分析[36]，但參照2002/657/EC中的相關(guān)規(guī)定，利用HPLC-MS/MS進行確證時需提供一個母離子，2 個子離子的信息。實驗經(jīng)過優(yōu)化，確定了番茄苷和番茄堿的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)，見表1。

表1 番茄堿和番茄苷多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of tomatine and tomatidine

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相組成優(yōu)化

實驗分別比較了0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%乙酸-乙腈溶液、5 mmol/L乙酸銨-乙腈溶液、5 mmol/L甲酸銨-乙腈溶液組成的流動相體系對番茄苷和番茄堿分離效果及響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明不同流動相組成體系均能將2 種化合物進行分離，乙腈的流動相體系響應(yīng)值高于甲醇體系，甲酸優(yōu)于乙酸，乙酸銨優(yōu)于甲酸銨。添加銨鹽后，2 種化合物的保留時間有不同程度的延長。優(yōu)化結(jié)果表明甲酸對番茄苷的響應(yīng)值有抑制作用，乙酸銨對番茄苷的響應(yīng)有明顯增強作用；而使用乙酸銨后番茄堿的響應(yīng)值和重復(fù)性變差?？紤]到同時檢測番茄中2 種主要的生物堿，實驗采用乙酸銨-乙腈體系，并在5 mmol/L乙酸銨溶液中加入了0.05%的甲酸，番茄苷和番茄堿即能良好的分離，也有較高的靈敏度和重復(fù)性。

2.2.2 色譜柱選擇

圖1 標準溶液中番茄苷和番茄堿總離子流圖和提取離子色譜圖Fig. 1 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine standards

分別比較Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）、Poroshell 120 C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）和SB C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）3 種不同型號的色譜柱對番茄苷和番茄堿分離效果及響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明Poroshell 120 C18色譜柱的分離效果和響應(yīng)值最好，其次是SB C18色譜柱，實驗最終選擇Poroshell 120 C18色譜柱。結(jié)果如圖1、2所示。

圖2 樣品提取液中番茄苷和番茄堿總離子流圖和離子提取色譜圖Fig. 2 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine in tomato extract

2.3 提取方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑優(yōu)化

圖3 提取溶劑對番茄苷和番茄堿的提取效果Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recovery of tomatine and tomatidine

參考已有相關(guān)文獻報道[24,27,29,34]，實驗采用1%乙酸溶液、5%乙酸溶液、10%乙酸溶液、85%乙醇溶液及100%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶5（g/mL），超聲提取2 次，每次30 min。以乙酸溶液為提取溶劑直接進行凈化處理，含有機溶劑的提取液去除有機溶劑后進行凈化。

從圖3可以看出，從1%乙酸溶液到10%乙酸溶液提取時，番茄苷含量無明顯差異，但番茄堿含量隨著乙酸溶液體積分數(shù)的增加，提取效率有增加。以100%乙醇為提取溶劑的提取效果低于85%乙醇溶液的提取效果。雖然85%乙醇溶液與10%乙酸溶液的提取效果無明顯差異，也有良好的提取效果，但該方法適合于番茄堿粗提物的提取制備[34,36]，對番茄樣品中番茄苷、番茄堿含量進行分析時需要去除大量有機溶劑后才能進行凈化處理，增加了分析的步驟，實驗最終選擇10%乙酸溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取方式優(yōu)化

實驗以10%乙酸溶液為提取劑，料液比1∶10，分別比較超聲、攪拌和勻漿3 種提取方式的提取效果，其中超聲提取的時間為30 min[36]，攪拌提取時間為2 h[27]，勻漿提取時間為3 min，結(jié)果見圖4。

圖4 提取方式對提取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction methods on the recovery of tomatine and tomatidine

目前番茄中生物堿的提取方式多采用超聲提取法[29,36]，但從圖4可以看出，3 種提取方式中，超聲的提取效果最差。攪拌提取[27]雖然與勻漿提取無明顯差異，但提取時間相對較長，實驗最終選擇勻漿提取方式。

2.3.3 提取時間、料液比優(yōu)化

實驗以勻漿提取方式，分別比較了勻漿1、2 min和3 min的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者無明顯差異，為保障提取完全，實驗選擇勻漿提取時間為2 min。實驗比較了料液比為1∶3、1∶4、1∶10（g/mL）的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者無明顯差異，考慮操作方便性和溶劑的消耗情況，實驗選擇料液比為1∶4。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍

將番茄苷配制成質(zhì)量濃度為50、100、250、500 ng/mL和1 000 ng/mL標準工作溶液，番茄堿配制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100 ng/mL標準工作溶液，按已建立測定條件進行分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。番茄苷的線性方程為y=422.37x＋9 905.6，相關(guān)系數(shù)為0.999 1；番茄堿的線性方程為y=66 213x-113 318，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，2 種化合物線性方程良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，滿足定性檢測方法的要求。

2.4.2 方法的準確度和精密度結(jié)果

方法的準確度采用添加回收實驗進行。分別向番茄樣品中添加番茄堿及番茄苷標準溶液，使番茄苷的添加量分別為5.00、10.0 mg/kg和20.0 mg/kg，番茄堿的添加量分別為50、100 μg/kg和200 μg/kg，按建立的方法進行提取、凈化和分析，添加回收率和精密度結(jié)果見表2。

表2 添加回收測定結(jié)果（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of tomatine and tomatidine (n= 6)

從表2可以看出，番茄苷回收率在86.0%～92.0%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～6.8%之間；番茄堿添加回收率在85.6%～105%之間，RSD在1.0%～6.1%之間，能滿足測定的需要。以10 倍信噪比計算，番茄苷的檢出限為1.0 μg/kg，番茄堿的檢出限為0.10 μg/kg。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

分別用溶劑和番茄基質(zhì)配制相同質(zhì)量濃度的標準工作液，進行色譜-質(zhì)譜分析，計算基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)/%=（基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1）×100[37]。利用HPLC-MS/MS進行分析時，由于有共流出組分的存在，會影響離子化效率，當基質(zhì)效應(yīng)為-20.0%～20.0%、-50.0%～-20.0%和20.0%～50.0%、小于-50.0%和大于50.0%時，分別表示輕微、中等、較強的基質(zhì)效應(yīng)[38]。可以通過改善色譜分離條件、對樣品進行凈化、基質(zhì)配制標準曲線等方式減少基質(zhì)對分析的影響。本實驗出現(xiàn)結(jié)果表明，番茄苷的基質(zhì)效應(yīng)為4.5%，番茄堿的基質(zhì)效應(yīng)為2.8%，均小于20%，基質(zhì)效應(yīng)較弱，因此可以用溶劑配制標準溶液進行樣品的定量分析。

2.5 樣品測定

2.5.1 樣品含量測定

采用本實驗建立的方法，對來自北京昌平番茄生產(chǎn)基地的樣品進行檢測，部分樣品檢測結(jié)果見表3。

表3 番茄樣品檢測結(jié)果Table 3 Contents of tomatine and tomatidine in tomatoes determined by the developed method

從表3可以看出，大番茄中番茄苷含量在6.06～37.54 mg/kg之間，番茄堿含量在0.18～25.54 μg/kg之間；櫻桃番茄中番茄苷含量在0.11～35.58 mg/kg之間，番茄堿含量在0.13～9.86 μg/kg之間。無論是大番茄還是櫻桃番茄中番茄苷的含量均明顯高于番茄堿，表明番茄生物堿主要是以糖苷生物堿的形式存在。番茄苷的生物活性高于番茄堿[4-5]，研究番茄中番茄苷的含量變化對保障食用安全有重要的意義。

2.5.2 成熟過程中番茄苷含量變化

選擇3 個不同品種的番茄，研究其在青熟期、轉(zhuǎn)色期、半熟期和完熟期等不同生長過程中番茄苷含量的變化規(guī)律。由圖5可以看出，3 個品種的番茄：壽研、浙粉、紅寶石在成熟過程中均呈現(xiàn)出下降趨勢，青熟期到半熟期下降速度較快，半熟期后下降趨于平緩，這與陶永霞等[24]報道一致。

圖5 番茄生長過程中番茄苷含量的變化Fig. 5 Changes of tomatine content during tomato growth

3 結(jié) 論

利用HPLC-MS/MS建立番茄中番茄苷和番茄堿的同時檢測方法。該方法簡單、快速、靈敏度高、重復(fù)性好，可滿足番茄中番茄苷與番茄堿的定性、定量分析。檢測結(jié)果表明，番茄中番茄苷的含量明顯高于番茄堿，番茄苷在成熟過程中呈下降趨勢，完熟后含量較低。