王振宇，胡慧敏，龔 迪，張國(guó)軍，Dov PRUSKY,3，畢 陽(yáng),*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.以色列農(nóng)業(yè)研究組織凡卡尼中心，中央?yún)^(qū) Bet Dagan 50250）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是一種重要的采后病原真菌，可侵染蘋果、梨甜瓜、杏、番茄等多種果實(shí)[1]。由該病原物引起的心腐病是蘋果果實(shí)采后的重要病害[2]，心腐病不僅會(huì)導(dǎo)致蘋果的品質(zhì)劣變，還會(huì)在果實(shí)體內(nèi)產(chǎn)生真菌毒素[3]。通過(guò)傷口及自然孔口進(jìn)入是T. roseum侵染果實(shí)的主要途徑[2]，但該病原菌侵染后如何在寄主體內(nèi)擴(kuò)展尚不明了。

采后真菌在侵染果實(shí)的早期，會(huì)分泌氨或有機(jī)酸來(lái)調(diào)控侵染點(diǎn)周邊的pH值，從而營(yíng)造有利于侵染的微環(huán)境[4]。有些真菌會(huì)分泌氨使寄主pH值升高，如Colletotrichum屬真菌侵染鱷梨[5]，Alternaria alternata侵染柿子[6]。有些則會(huì)分泌有機(jī)酸使寄主pH值降低，如Penicillium expansum和Penicillium digitatum侵染蘋果[7]。由于病原真菌的這些酸化或堿化特性，故將其分為酸化菌與堿化菌兩類。當(dāng)敲除堿化菌Colletotrichum gloeosporioides分泌氨的基因GDH2時(shí)，其對(duì)番茄的致病性顯著降低[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH值直接調(diào)控了病原真菌胞外酶的分泌與活性。當(dāng)pH值大于5.8時(shí)，C. gloeosporioides開(kāi)始分泌果膠裂解酶，pH值低于5.7時(shí)則不分泌[9]。Phomopsis mangiferae在pH 4時(shí)分泌的多聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于pH 7[10]。編碼Monilinia fructicola的兩個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因MFPG2和MFPG3，在pH 3.6～3.7時(shí)的表達(dá)量顯著高于pH 4.5[11]。A. alternata分泌的內(nèi)切1,4-β-葡聚糖酶在pH 6時(shí)的活性明顯高于pH 4[12]。

雖然已有多種采后病原真菌通過(guò)改變宿主pH值影響其致病性的報(bào)道，但是T. roseum侵染蘋果后病部pH值如何變化，環(huán)境pH值如何調(diào)控該病原菌的致病力和胞外酶活性卻鮮有報(bào)道。本研究以“富士”蘋果為試材，采用T. roseum損傷接種果實(shí)，觀察接種果實(shí)病斑處的pH值變化，研究3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑的影響，分析損傷接種果實(shí)病斑處果膠酶及纖維素酶活性變化。以期明確T. roseum的酸堿特性，為揭示該病原物的部分致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試T. roseum由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試“富士”蘋果于2017年10月采自甘肅省景泰縣國(guó)營(yíng)條山集團(tuán)蘋果生產(chǎn)基地，選取外觀整齊、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，單果套網(wǎng)套后入瓦楞紙包裝箱，于當(dāng)天運(yùn)抵本實(shí)驗(yàn)室，于常溫（20～25 ℃）、相對(duì)濕度70%～80%條件下貯藏待用。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯工業(yè)有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；1510-04087型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同pH值孢子懸浮液的配制

參照Eshel等[6]方法并修改。先將保存的T. roseum回接到果實(shí)上以活化其致病力，將活化分離成功的菌種在25 ℃培養(yǎng)7 d，分別加入pH值為3、5、7的無(wú)菌磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液10 mL/皿，用涂布器輕輕刮下培養(yǎng)基表面的孢子，經(jīng)4 層紗布過(guò)濾后，將濾液轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，加入大約0.05% Tween-80后搖勻，在旋渦混合器上振蕩數(shù)秒，使孢子分布均勻，采用血球計(jì)數(shù)板法將孢子懸浮液濃度調(diào)至1.0×106spores/mL。

1.3.2 損傷接種

參照李燦嬰等[12]的方法。挑選果形端正、大小均勻、成熟度、色澤一致、無(wú)病蟲(chóng)害和機(jī)械傷的果實(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈后自然晾干，再用1%的次氯酸鈉對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，晾干后，用70%乙醇棉球?qū)臃N部位進(jìn)行表面擦拭消毒，然后用滅菌鐵釘于果實(shí)中部打4 個(gè)深3 mm、直徑3 mm的接種孔?？變?nèi)分別接入上述不同pH值的孢子懸浮液10 μL，以接入等量含0.05% Tween-80的無(wú)菌水為對(duì)照，稍作晾干后裝入聚乙烯袋中（6 個(gè)/袋），于室溫（（22±3）℃）、相對(duì)濕度85%～90%下貯藏待測(cè)。分別在接種后的0、3、6、9 d和12 d測(cè)量病斑直徑，每處理每一時(shí)間點(diǎn)用果實(shí)20 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.3 果實(shí)腐爛組織與健康組織pH值的測(cè)定

參照Bi Fangchen等[8]方法，用無(wú)菌手術(shù)刀取樣組織并在無(wú)菌研磨機(jī)中研磨，將研磨的組織以10 621×g離心5 min，將上清液用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。每處理每一時(shí)間點(diǎn)用果實(shí)20 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.4 接種部位pH值的維持

參照Eshel等[6]方法，自接種伊始，每隔12 h分別向接種孔中注入pH值為3、5及7的無(wú)菌磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，直至取樣結(jié)束。

1.3.5 生化測(cè)定取樣

參照李燦嬰等[12]方法。取病斑組織及病健交界處3 mm以內(nèi)的果肉組織。切碎后稱取3 g，鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。每處理每一時(shí)間點(diǎn)用果實(shí)10 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.6 胞外酶活性測(cè)定

1.3.6.1 粗酶液的提取

果膠甲基多聚半乳糖醛酸酶（pectin methyl polygalacturonase，PMG）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、纖維素酶（cellulase，Cx）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Glu）的提取參考劉耀娜等[13]的方法。取3 g冷凍組織，置于預(yù)冷的研缽中，加入6 mL預(yù)冷的95%乙醇溶液，在冰浴條件下研磨勻漿后，全部轉(zhuǎn)入離心管，然后4 ℃、10 000×g離心10 min，傾去上清液，向沉淀物中再加入3 mL預(yù)冷的80%乙醇溶液，振蕩，低溫放置10 min，然后在相同條件下離心，再傾去上清液，向沉淀物中加入5 mL預(yù)冷的提取緩沖液，于4 ℃放置提取20 min，再經(jīng)過(guò)離心后收集上清液即為粗酶液。

果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）粗酶液的提取參照Hagerman等[14]方法并修改。取3 g冷凍組織，置于冰浴的研缽中，加入5 mL 8.8% NaCl溶液在冰浴條件下研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入到離心管中，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5后即為粗酶液。

果膠裂解酶（pectatelyase，PL）粗酶液提取參照陳夕軍等[15]方法。取3 g冷凍組織，置于冰浴的研缽中，加入6 mL的提取緩沖液（50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，含1 mol/L NaCl），在冰浴條件下研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入到離心管中，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.6.2 酶活性的測(cè)定

PMG活性的測(cè)定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到0.5 mL 10 g/L果膠溶液和1.0 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，37 ℃水浴1 h，加入1.5 mL的3,5-二硝基水楊酸并立即沸水浴5 min，迅速冷卻后加蒸餾水8 mL之后混勻，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。PMG活性用每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時(shí)將多聚半乳糖醛酸在37 ℃催化水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

PG活性的測(cè)定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到0.5mL 10 g/L多聚半乳糖醛酸溶液和1.0 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，37 ℃水浴1 h，加入1.5 mL的3,5-二硝基水楊酸試劑并立即進(jìn)行5 min沸水浴，迅速冷卻，加蒸餾水8 mL之后混勻，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。PG活性用每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時(shí)將多聚半乳糖醛酸在37 ℃催化水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

Cx活性的測(cè)定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到1.5 mL 10 g/L羧甲基纖維素鈉溶液混勻，37 ℃水浴1 h，迅速將1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑加入并進(jìn)行5 min的沸水浴，迅速冷卻后加蒸餾水8 mL進(jìn)行混勻，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。Cx活性以每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時(shí)將羧甲基纖維素在37 ℃催化水解并生成還原糖（葡萄糖）的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

β-Glu活性的測(cè)定參照劉耀娜等[13]的方法。取0.5 mL粗酶提取液，加入1.5 mL 10 g/L水楊苷溶液， 37 ℃水浴1 h，迅速加入3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL，再進(jìn)行5 min沸水浴后迅速冷卻，加入蒸餾水8 mL并混勻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。β-Glu活性以每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時(shí)將水楊苷在37 ℃水解成還原糖（葡萄糖）的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

PME活性的測(cè)定參照Hagerman等[14]方法。反應(yīng)液包括4 mL 0.5%果膠溶液、0.3 mL 0.01%溴麝香草酚蘭，在加入粗酶液前初始A620nm約為0.091，加500 μL粗酶液，反應(yīng)2 min后測(cè)定其吸光度，酶活性以每分鐘吸光度的變化值ΔA620nm表示。

PL活性參照陳夕軍等[15]方法。取2.0 mL的0.5%果膠溶液于試管中，40 ℃水浴平衡5 min，加入0.5 mL粗酶液，40 ℃水浴平衡10 min，取上述反應(yīng)混合物0.5 mL，加入4.5 mL 0.01 mol/L的HCl溶液中，充分混和終止反應(yīng)。在235 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每分鐘235 nm波長(zhǎng)處吸光度增加1.0定義為1單位PL活性，以ΔA235nm表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 病部組織pH值的變化及3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑直徑的影響

圖1 接種T. roseum后果實(shí)病斑處pH值的變化（A）及3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)病斑直徑（B）的影響Fig. 1 pH change in lesion of fruit inoculated with T. roseum (A), and effect of inoculation with spore suspensions at three different pH values on lesion diameter (B)

如圖1A所示，果實(shí)接種T. roseum后，病部組織的pH值隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)明顯上升，由第0天的3.54增加到第12天的4.84，提高了36.7%。對(duì)照組織的pH值雖然也有升高，但增加幅度不大。由于接種病原物的組織pH值在接種3 d后均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），表明T. roseum堿化了果實(shí)傷口處的微環(huán)境，該菌屬堿化菌。

如圖1B所示，不同pH值孢子懸浮液接種后果實(shí)的病斑直徑存在顯著差異，其中pH 7的病斑直徑最大，其次為pH 5，pH 3最小。接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種果實(shí)的病斑直徑分別高出pH 5和pH 3的35.2%和68.0%（P＜0.05）。

2.2 3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑處果膠酶活性的影響

圖2 3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑處PME（A）、PG（B）、PMG（C）和PL（D）活性的影響Fig. 2 Effects of inoculation with spore suspensions at three different pH values on the activities of PME (A), PG (B), PMG (C) and PL (D)

3 種pH值孢子懸浮液接種后病斑處的果膠酶活性表現(xiàn)各異，整體上以pH 7的活性最大（圖2）。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處的PME活性在第6天和第9天最高，顯著高于pH 5和pH 3孢子懸浮液接種，接種后第9天，分別為pH 5與pH 3處理的2 倍與2.95 倍（P＜0.05）（圖2A）；雖然pH 5孢子懸浮液接種果實(shí)病斑處的PME活性在第3、6、9天也高于pH 3孢子懸浮液接種，但兩者之間無(wú)顯著差異。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處的PG活性在第9天最大，顯著高于pH 5與pH 3孢子懸浮液接種的活性。接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種的PG活性分別為pH 5與pH 3接種的1.39 倍和1.68 倍（P＜0.05）；第3天與第9天，pH 5孢子懸浮液接種的PG活性也顯著高于pH 3孢子懸浮液（P＜0.05）（圖2B）。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處的PMG活性在第6天和第9天最高，顯著高于pH 5與pH 3孢子懸浮液接種的活性，接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種的PMG活性分別為pH 5與pH 3接種的1.25 倍和1.61 倍（P＜0.05）；第3天與第9天pH 5孢子懸浮液接種的PMG活性也顯著高于pH 3孢子懸浮液接種（P＜0.05）（圖2C）。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處的PL活性在第12天最大，顯著高于pH 5和pH 3孢子懸浮液，pH 5與pH 3孢子懸浮液接種后病斑處PL活性在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異。第12天時(shí)pH 7活性與pH 3差異最顯著（P＜0.05）（圖2D）。

2.3 3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑處Cx和β-Glu活性的影響

圖3 3 種pH值孢子懸浮液接種對(duì)果實(shí)病斑處CX（A）和β-Glu（B）活性的影響Fig. 3 Effects of inoculation with spore suspensions at three different pH values on the activities of Cx (A) and β-Glu (B)

3 種pH值孢子懸浮液接種后病斑處的纖維素酶整體上以pH 7的活性最大，pH 5次之，pH 3最?。▓D3）。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處Cx活性在第9天時(shí)最大，分別為pH 5和pH 3接種的1.33 倍與1.97 倍（P＜0.05），且pH 5孢子懸浮液接種的Cx活性也高于pH 3接種的51.5%（圖3A）。pH 7孢子懸浮液接種后果實(shí)病斑處β-Glu活性在第9天最大，分別為pH 5與pH 3接種活性的1.3 倍與1.64 倍，pH 5孢子懸浮液接種高出pH 3接種的26.9%（P＜0.05）（圖3B）。

3 結(jié)論與討論

接種了T. roseum的蘋果果實(shí)，病斑處的pH值顯著升高，表明該菌屬堿化菌。采用3 種pH值孢子懸浮液接種后發(fā)現(xiàn)，pH 7處理蘋果果實(shí)的病斑直徑最大，表明高pH值環(huán)境更有利于T. roseum致病。

pH 7孢子懸浮液接種導(dǎo)致了蘋果果實(shí)病健交界處最高的果膠酶和纖維素酶活性，而pH 3接種導(dǎo)致了最低的活性，表明高pH值有利于T. roseum胞外酶的活化。果實(shí)受到真菌侵染后大多發(fā)生組織潰爛，真菌分泌的胞外酶在其中發(fā)揮了重要作用[16]。傷口侵染性真菌分泌的胞外酶主要由果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等組成，其中以果膠酶的功能最為強(qiáng)大。果膠酶是一組復(fù)合酶，由PME、PG、PMG、PL等組成，主要在降解細(xì)胞壁及中膠層的果膠物質(zhì)中發(fā)揮作用[17]。果實(shí)細(xì)胞壁和中膠層中果膠主鏈的多聚半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)單位被甲醇高度酯化，故PME先催化主鏈的脫甲酯化并產(chǎn)生自由羧基群，同時(shí)釋放甲醇[18]。甲醇的釋放導(dǎo)致細(xì)胞壁pH值降低，從而更有利于PG發(fā)揮作用[19]。PG可水解細(xì)胞壁和中膠層中的多聚半乳糖醛酸中的α-1,4糖苷鍵，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，從而導(dǎo)致中膠層破壞和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松散，致使果實(shí)組織軟化、潰爛[20]。本研究pH 7孢子懸浮液接種果實(shí)的病斑處具有較高的PME和PG活性，與前人研究結(jié)果類似。Sakai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PME作用的最佳pH值為7左右。陳夕軍[22]和宋丹丹[23]等也發(fā)現(xiàn)，PG在pH 7時(shí)的活性顯著高于pH 3時(shí)的活性。PMG是一種專一水解底物糖苷鍵的水解酶，對(duì)底物的酯化度具有高度的選擇性，可水解高度酯化的果膠酸酯的α-1,4糖苷鍵[24]。本研究pH 7孢子懸浮液接種后病斑處PMG活性較高，表明PMG在T. roseum的侵染中后期發(fā)揮了重要作用，該結(jié)果與楊迎青等[24]研究類似。PL能夠催化降解半乳糖醛酸，通過(guò)β消除作用，在其非還原端產(chǎn)生帶有4-脫氧-α-D-半乳糖-4-烯醛酸基團(tuán)的不飽和低聚糖，本研究pH 7孢子懸浮液接種后病斑處PL活性較高，與周人綱等[25]研究結(jié)果類似。不同pH值導(dǎo)致的果膠酶活性差異與編碼果膠酶的不同基因家族成員在不同的pH值環(huán)境水平下被激活有關(guān)[7]。例如，堿化菌C. gloeosporioides僅在pH值高于5.7時(shí)，編碼PL的基因pel才會(huì)表達(dá)，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的PL活性[26]。當(dāng)敲除C. gloeosporioides產(chǎn)生氨的基因GDH2后，突變株接種后病斑處pH值未發(fā)生顯著變化，編碼PG的基因表達(dá)量也明顯降低[27]。

纖維素酶主要由Cx和β-Glu等組成[28]，通常是在腐爛發(fā)生的后期發(fā)揮作用[29]，Cx可分解纖維素中的β-1,4糖苷鍵，最終形成纖維二糖[30]。本研究pH 7孢子懸浮液接種的Cx活性顯著高于pH 3和pH 5孢子懸浮液接種，該結(jié)果與耿麗平等[31]研究的草酸青霉（Penicillium oxalicum）在pH 4～7時(shí)均可產(chǎn)生Cx，但在pH 7時(shí)酶活性最高的結(jié)果一致。β-Glu主要水解非還原性末端的β-D-糖苷鍵生成β-D-葡萄糖[32]。本研究pH 7孢子懸浮液接種的β-Glu活性較高，與周進(jìn)等[33]的結(jié)果相似。不同的環(huán)境pH值會(huì)激活纖維素酶基因家族的不同成員[7]。