李煥芹，牛 敏，劉淑敏，宋貴波，杜 艷

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所，云南 昆明 650032)

耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)已成為醫(yī)院獲得性感染的重要病原體，感染者病死率高，疾病負(fù)擔(dān)重，治療方案有限，且菌株可通過質(zhì)粒、整合子和插入序列等水平播散，給臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)[1-3]。多粘菌素B是一種環(huán)狀多肽抗生素，于1947年發(fā)現(xiàn)，主要是多粘菌素B和E，其帶正電荷性質(zhì)，與革蘭陰性菌菌膜上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合，導(dǎo)致脂多糖(LPS)不穩(wěn)定，改變菌膜的滲透性，同時(shí)還能抑制重要的還原酶(如菌膜中的II型NADH醌氧化還原酶)，從而發(fā)揮抗菌作用[4-7]。多粘菌素被廣泛用于治療革蘭陰性桿菌引起的嚴(yán)重感染，直到二十世紀(jì)八十年代，因其腎毒性和神經(jīng)毒性被逐漸停用，但由于CRE菌株抗感染缺乏新的有效抗菌藥物，導(dǎo)致多粘菌素被重新引入臨床抗感染治療中[8-10]，隨著多粘菌素B的大量使用，世界范圍內(nèi)對(duì)多粘菌素B耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌相繼出現(xiàn)并逐年增多[11-12]。鑒于臨床上CRE菌株對(duì)多粘菌素B體外敏感性檢測(cè)相關(guān)的臨床研究較少，臨床經(jīng)驗(yàn)有限，迫切需要快速、準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床合理用藥。

最低抑菌濃度(MIC)是極有價(jià)值的藥物敏感性試驗(yàn)數(shù)值，為臨床制定合理用藥方案、調(diào)整用藥方案及實(shí)施個(gè)性化用藥提供依據(jù)[13]。臨床上測(cè)定MIC值的方法有瓊脂稀釋法、微量肉湯稀釋(broth mirodilution，BMD)法、E-test法以及自動(dòng)化分析儀法，其中E-test法是一種簡(jiǎn)便且可測(cè)定各種微生物(包括苛養(yǎng)菌)體外藥物敏感性的替代方法，但因其在多粘菌素B敏感性測(cè)定方法中的應(yīng)用不同導(dǎo)致研究結(jié)果不同，研究[14-16]表明其與BMD法在MIC值上保持一致，也有研究[17]報(bào)道因藥物在瓊脂中擴(kuò)散不均，其結(jié)果并不十分可靠。本研究收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年1—12月分離于臨床各科室患者的非重復(fù)CRE菌株230株，通過比較E-test法與BMD法檢測(cè)CRE菌株對(duì)多粘菌素B的敏感性差異，評(píng)估E-test法的臨床應(yīng)用效果，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2018年1—12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床各科室送檢的非重復(fù)CRE菌株230株，藥敏質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2和配套的GN卡、AST-GN14卡均購于法國生物梅里埃公司。插入式多粘菌素B藥敏試紙條(E-test法)、多粘菌素B藥敏試劑板條(BMD法)、藥敏接種培養(yǎng)液均由溫州市康泰生物科技有限公司提供；MH瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn) 采用插入式E-test試紙條法和微量肉湯稀釋法進(jìn)行MIC值檢測(cè)，嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明書兩種方法同時(shí)進(jìn)行，兩名專業(yè)人員同時(shí)讀取數(shù)據(jù)。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷 參照2018年歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)藥敏委員會(huì)(EUCAST)折點(diǎn)判斷[18]，質(zhì)控菌株ATCC 25922 MIC值范圍在(0.25～2)μg/mL表明在質(zhì)控范圍內(nèi)。試驗(yàn)菌株MIC≤2 μg/mL判定為敏感(S)，MIC>2 μg/mL判定為耐藥(R)。

1.4 數(shù)據(jù)分析 MIC值定義為在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測(cè)試驗(yàn)中能抑制肉眼可見的微生物生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度；以BMD法為標(biāo)準(zhǔn)，基本一致性(essential agreement，EA)：待測(cè)MIC系統(tǒng)與參考方法MIC值相差不超過1個(gè)稀釋倍數(shù)；分類一致性(categorical agreement，CA)：被評(píng)估藥敏方法與參考方法判斷試驗(yàn)結(jié)果為敏感、中介、耐藥的一致性；極重大誤差 (very major error，VME)：將耐藥誤判為敏感，即假敏感；重大誤差(major error，ME)：將敏感誤判為耐藥，即假耐藥；小誤差(minor error；mE)：將中介判為敏感或耐藥、或者將耐藥或敏感判為中介[5]。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)要求，能接受的誤差范圍CA和EA均≥90%，VME≤1.5%，ME<3%，mE≤10%[19]。

2 結(jié)果

2.1 E-test法和BMD法測(cè)定質(zhì)控菌株大腸埃希菌的MIC值 E-test法檢測(cè)質(zhì)控菌株ATCC 25922對(duì)多粘菌素B的MIC為0.5 μg/mL，BMD法測(cè)定的MIC為0.25 μg/mL，均在質(zhì)控范圍內(nèi)(0.25～2 μg/mL)。

2.2 標(biāo)本來源及病原菌分布特點(diǎn) 標(biāo)本來源以痰為主(163株)，占70.87%，其次是血(33株，14.35%)和分泌物(15株，6.52%)；尿、引流液、腦脊液分別占3.48%、3.04%、1.74%。病原菌分布以肺炎克雷伯菌為主(205株)，其次為陰溝腸桿菌(14株)和大腸埃希菌(7株)。

2.3 兩種方法測(cè)定菌株對(duì)多粘菌素B的藥敏結(jié)果

2.3.1 兩種藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)CRE對(duì)多粘菌素B敏感性的差異 通過比較E-test法和BMD法，E-test法敏感率較高，為96.52%，BMD法耐藥率較高，占4.35%，見表1。

表1兩種藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)230株CRE對(duì)多粘菌素B藥敏結(jié)果[株(%)]

Table1Susceptibility testing result of 230 strains of CRE to polymyxin B detected by two antimicrobial susceptibility testing methods (No. of isolates[%])

藥敏試驗(yàn)方法敏感耐藥E-test法222(96.52)8(3.48)BMD法220(95.65)10(4.35)

2.3.2 兩種藥敏試驗(yàn)方法比較CRE對(duì)多粘菌素B的MIC值變化 經(jīng)E-test法測(cè)得多粘菌素B的MIC50、MIC90均為0.5 μg/mL，BMD法對(duì)多粘菌素B的MIC50、MIC90為0.5、1 μg/ mL，MIC90值E-test法的MIC較BMD法低1個(gè)稀釋度，藥敏試驗(yàn)方法的誤差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以BMD法為參考方法，兩種方法基本一致率95.65%，分類一致率99.13%，mE 0，ME 0，VME 0.87%。見表2、圖1。

表2E-test法和BMD法檢測(cè)CRE對(duì)多粘菌素B的MIC比較(μg/mL)

Table2Comparison in minimum inhibitory concentrations of CRE to polymyxin B detected by E-test method and BMD method(μg/mL)

藥敏方法MIC范圍MIC50MIC90E-test法0.125～128 0.50.5BMD法0.25～128 0.51.0

3 討論

CHINE細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近年來CRE菌株呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤其是肺炎克雷伯菌，多粘菌素耐藥的CRE菌株引起的感染治療選擇極其有限且病死率高，本研究中CRE菌株對(duì)多粘菌素耐藥僅3.48%和4.35%，與國內(nèi)其他醫(yī)院耐藥率4.4%相近[20]，耐藥率尚低，兩種方法MIC50均為0.5 μg/mL，MIC90分別為0.5、1 μg/mL，E-test法最低MIC值為0.125 μg/mL，BMD法最低MIC值為0.25 μg/mL，E-test法的敏感率為96.52%，BMD法的敏感率為95.65%，表明多粘菌素B對(duì)CRE菌株有很好的抗菌活性，故在臨床CRE抗感染治療中，可經(jīng)驗(yàn)性選擇使用。

注：散點(diǎn)圖結(jié)果是將E-test法確定的多粘菌素MIC值(橫坐標(biāo))與BMD確定的MIC值(縱坐標(biāo))進(jìn)行比較。對(duì)角黑線表示完全一致，數(shù)字代表在每個(gè)點(diǎn)觀察到的事件，虛線表示測(cè)試結(jié)果之間相差一個(gè)稀釋度的MIC值。水平和垂直虛線表示耐藥折點(diǎn)(>2 μg/mL)

圖1E-test法與BMD確定的MIC散點(diǎn)圖

Figure1Scatter diagram of minimum inhibitory concentrations determined by E-test method and BMD method

多粘菌素B的體外藥敏試驗(yàn)存在諸多挑戰(zhàn)，缺乏可靠的藥敏試驗(yàn)參考方法，多粘菌素存在多組分構(gòu)成問題，在瓊脂中擴(kuò)散不良，還有其陽離子的吸附性質(zhì)、異抗性的出現(xiàn)及培養(yǎng)基貯藏的影響等[11]，故目前對(duì)多粘菌素敏感性試驗(yàn)方法還未在國際上達(dá)成共識(shí)。EUCAST推薦使用BMD法測(cè)定多粘菌素的MIC值，并制定了粘菌素藥敏結(jié)果的折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)。目前多粘菌素B體外敏感性試驗(yàn)可采用瓊脂擴(kuò)散法、BMD法、E-test法和自動(dòng)化分析法檢測(cè)，研究[21]表明瓊脂擴(kuò)散法與BMD法一致性良好，但兩種方法均操作復(fù)雜，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)施；另一個(gè)問題是多粘菌素B容易吸附到聚苯乙烯中，本次試驗(yàn)菌株有127株BMD測(cè)定的MIC值較E-test高1個(gè)稀釋度，考慮該試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)原因?yàn)槎嗾尘谺對(duì)塑料的吸附導(dǎo)致在微孔中分配的藥物實(shí)際濃度低于標(biāo)準(zhǔn)濃度。E-test法是近年來研究的新型方法，以其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠的優(yōu)勢(shì)已被越來越多應(yīng)用于苛養(yǎng)菌、真菌以及多重耐藥菌MIC值的測(cè)定，本試驗(yàn)使用的藥敏紙條又稱為梳齒狀藥敏試紙條，為插入式E-test試紙條，是我國自主設(shè)計(jì)、專利生產(chǎn)的梯度濃度藥敏試條，通過將含有黏附作用的緩釋劑將抗菌藥物附著在梳狀藥敏試條的梳齒下部，結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，定量檢測(cè)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，插入式E-test試紙條不會(huì)產(chǎn)生平放式E-test試紙條會(huì)產(chǎn)生的氣泡等干擾因素，插入瓊脂后近乎一條直線，在讀取抑菌圈橢圓的邊與試紙條相交點(diǎn)時(shí)更直觀，在操作上更簡(jiǎn)便[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示E-test法和BMD的基本一致率為95.65%，分類一致率高達(dá)99.13%，與各項(xiàng)研究結(jié)果顯示E-test法和參考方法BMD之間存在良好的相關(guān)性一致[14]，故臨床實(shí)驗(yàn)室可考慮采用E-test法進(jìn)行多粘菌素B的常規(guī)敏感性檢測(cè)。

本研究有3株CRE敏感菌株，BMD法出現(xiàn)了跳孔現(xiàn)象，3株前后孔表現(xiàn)一致，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能是污染，以及多粘菌素B異質(zhì)性耐藥的出現(xiàn)[23]。異質(zhì)性耐藥是指在體外藥敏試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的大部分亞群屬于敏感，但有一小部分亞群出現(xiàn)耐藥，作為一種獨(dú)特的耐藥現(xiàn)象，已經(jīng)成為抗菌治療的新挑戰(zhàn)。針對(duì)多粘菌素B的異質(zhì)性耐藥問題，可以通過加大劑量和聯(lián)合用藥來解決異質(zhì)性耐藥的問題，達(dá)到臨床治療效果。本研究中VME為0.87%，CLSI能接受的誤差范圍為VME≤1.5%，仍在可控范圍內(nèi)。分析出現(xiàn)“假敏感”現(xiàn)象的原因可能是人員操作差異，避免此類誤差的方法是規(guī)范操作。本次試驗(yàn)BMD法檢測(cè)出10株耐藥菌株，其中2株與E-test結(jié)果不符，其原因尚不明。

綜上所述，CRE對(duì)多粘菌素B有較好的抗菌活性，是抗感染治療的重要藥物，BMD法目前是檢測(cè)多粘菌素B體外藥物敏感性的推薦方法，但是其操作較為繁瑣且對(duì)藥物及培養(yǎng)基要求較高，本研究表明E-test法和BMD法在0.25～1 μg/mL時(shí)一致性良好，試驗(yàn)中使用的垂直插入式E-test試紙條較傳統(tǒng)的E-test平放試紙條有一定優(yōu)勢(shì)，一定程度上解決了藥物在瓊脂中難擴(kuò)散及多粘菌素B對(duì)塑料的吸附問題的缺點(diǎn)，E-test法操作簡(jiǎn)便，和BMD法一致性好，可以應(yīng)用于臨床常規(guī)藥敏試驗(yàn)，同時(shí)BMD法需規(guī)范試劑廠家生產(chǎn)規(guī)格。