王桂玲，房建強(qiáng)，費(fèi)洪榮，趙 瑩

(山東第一醫(yī)科大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山東 泰安 271016)

半枝蓮又名通經(jīng)草、并頭草、牙刷草等，為唇形科黃芩屬植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don 的干燥全草，可用于癌癥、咽喉腫痛、疔瘡腫毒等治療。其含有的成分主要有黃酮類、二萜類、生物堿類、甾類等。白花蛇舌草又名蛇舌癀、鶴舌草、白花十字草等，為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb.的干燥全草，可用于肺熱咳喘、腫瘤、瘡腫熱癰等治療，其含有的成分主要有黃酮類、萜類、蒽醌類、多糖等[1-6]。兩者都屬于清熱解毒類中藥，符合“七情和合”的理論和組合原則，在臨床上多以藥對的形式應(yīng)用對炎癥、腫瘤的治療。而黃酮類化合物作為兩者共有的活性成分，在藥對組方的許多生物活性中發(fā)揮了重要作用[7-9]。

本研究以半枝蓮和白花蛇舌草藥對中的總黃酮作為研究對象，以總黃酮提取率、浸膏量為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合L9(34)正交試驗(yàn)考察影響黃酮提取的各個因素，篩選出最佳的提取工藝條件。再結(jié)合靜態(tài)和動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)篩選聚酰胺樹脂純化總黃酮的最佳工藝參數(shù)。與以往藥對提取、純化工藝相比，本研究可以最大限度地開發(fā)半枝蓮和白花蛇舌草藥對中共有的黃酮類成分，為后續(xù)藥對的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、材料和試藥

1.1 儀器

UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-520DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EYELA冷凍干燥機(jī)FDU-1200(寧波新芝凍干設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥和材料

半枝蓮(批號20160610，山東晟銀多寶中藥飲片科技有限公司)；白花蛇舌草(批號160311，亳州市中正中藥材飲片有限公司)；蘆丁對照品(批號17111601，純度98%，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)；聚酰胺樹脂(60～100目，上海維塔化學(xué)試劑有限公司)；三氯化鋁 (上海廣諾化學(xué)科技有限公司，分析純) 。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥對中總黃酮的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備

稱取蘆丁對照品適量，置于25 ml量瓶中，甲醇溶解，制成0.1 mg/ml的蘆丁對照品溶液。

2.1.2 顯色溶液的制備

稱取AlCl3適量置于500 ml量瓶中，甲醇溶解，制成10% AlCl3的顯色溶液。

2.1.3建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]

量取“2.1.1”項(xiàng)對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml置于10 ml量瓶中，各加AlCl3溶液3 ml，甲醇定容，混勻靜置15 min，在429 nm 波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：

A=22.697C+0.044 7 (r=0.999 0)

表明對照品在0.003～0.015 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4精密度試驗(yàn)

精密稱取“2.1.1”項(xiàng)蘆丁對照品溶液0.5 ml，共6份，分別置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)操作測定吸光度，結(jié)果RSD為0.73%，表明該方法精密度較好。

2.1.5重現(xiàn)性試驗(yàn)

按配比4∶1稱取半枝蓮和白花蛇舌草藥對共6份，每份3.6 g，先用石油醚超聲處理，過濾，濾渣晾干，加入25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，回流提取2 h，合并提取液，回收乙醇，水溶液部分濃縮定容，作為樣品溶液，分別移取各樣品溶液0.3 ml置于10 ml容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)操作測定吸光度，結(jié)果RSD為1.58%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.3.2”項(xiàng)操作制備的樣品溶液0.3 ml置于10 ml容量瓶中，在429 nm處每隔10 min測定一次吸光度，1 h內(nèi)測得吸光度的RSD為1.71%，表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.1.7回收率試驗(yàn)

量取已知含量的樣品溶液3份，每份0.3 ml，精密加入蘆丁對照品溶液各3.1 ml，混勻，分別移取適量，按“2.1.3”項(xiàng)操作測定吸光度，計(jì)算回收率。

表1 半枝蓮和白花蛇舌草藥對加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1藥對不同配比對總黃酮提取率的影響

分別按半枝蓮:白花蛇舌草配比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的比例稱取6份，每份3.6 g，先用石油醚超聲處理，過濾，濾渣晾干備用。將濾渣各用20倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，回流提取1 h，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，定容至刻線，混勻，分別用移液管移取10 ml溶液轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，定容至刻線，混勻，各移取適量于坩堝中，蒸干，少量甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，三氯化鋁溶液3 ml，甲醇定容，混勻，靜置15 min，在429 nm波長處測定吸光度，按“2.1.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮的提取率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 藥對不同配比對總黃酮提取率的影響

從圖1可以看出，隨著半枝蓮與白花蛇舌草按規(guī)定的配比不斷發(fā)生變化時，黃酮提取率呈現(xiàn)出大幅增加趨勢，當(dāng)配比為3∶1時黃酮提取率出現(xiàn)一個小高峰，而后雖有增加但增加幅度不明顯，故選擇半枝蓮與白花蛇舌草配比為3∶1。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對藥對中總黃酮提取率的影響

按半枝蓮與白花蛇舌草配比3∶1，稱取6份，每份3.6 g，先用石油醚超聲處理，過濾，濾渣晾干備用。將濾渣分別用體積分?jǐn)?shù)的20倍量乙醇40%、50%、60%、70%、80%、90%，回流提取1 h，過濾，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對藥對總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)比例不斷增加，總黃酮提取率逐漸增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時提取率較大，隨后提取率逐漸下降，因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3料液比對藥對中總黃酮提取率的影響

按半枝蓮與白花蛇舌草配比3∶1，稱取6份，每份3.6 g，先用石油醚超聲處理，過濾，濾渣晾干備用。將濾渣分別用體積分?jǐn)?shù)為70%的10、15、20、25、30、35倍量的乙醇，回流提取1 h，過濾，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對藥對總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，隨著料液比比例不斷增加，總黃酮提取率出現(xiàn)大幅增加趨勢，當(dāng)料液比為1∶20時，提取率較高，而后增加幅度不明顯，所以確定料液比1∶20為宜。

2.2.4提取時間對藥對中總黃酮提取率的影響

按半枝蓮與白花蛇舌草配比3∶1，稱取6份，每份3.6g，先用石油醚超聲處理,過濾，濾渣晾干備用。將濾渣分別用20倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取，時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，過濾，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對藥對總黃酮提取率的影響

從圖4可以看出，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率出現(xiàn)大幅增加趨勢，但提取時間達(dá)到2 h后提取率呈緩慢增加趨勢，從節(jié)省能源角度考慮，因此確定提取時間2 h為宜。

2.3 藥對中總黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)的報道，確定以藥對中兩者配比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間作為4個考察因素，每個因素設(shè)3個水平，以總黃酮提取率和浸膏量為考察指標(biāo)，具體的因素、水平如表2所示。

表2 藥對中總黃酮提取的因素和水平表

2.3.2樣品溶液的制備及含量測定

按配比稱取半枝蓮和白花蛇舌草藥對總重3.6 g，先用石油醚超聲處理，過濾，濾渣晾干備用。將晾干的濾渣按表2 L9(34)正交試驗(yàn)的工藝條件分別進(jìn)行提取，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)。將溶液回收乙醇，濃縮、干燥，稱重，即得浸膏量，結(jié)果如表3、4、5所示。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 藥對中總黃酮提取率的方差分析結(jié)果

*P<0.1，有顯著性意義

表5 藥對中總黃酮浸膏量的方差分析結(jié)果

*P<0.1，有顯著性意義

由表3極差(R)可知，各提取因素影響大小順序?yàn)椋毫弦罕?C)配比(A)提取時間(D)乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)，根據(jù)K值，料液比為1∶25；乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%；配比為4∶1；提取時間為2 h。由表4、表5方差分析可知，料液比對總黃酮的提取率、浸膏量都有顯著影響、而提取時間、配比只對總黃酮的提取率有顯著影響。

綜合以上分析，確定半枝蓮和白花蛇舌草總黃酮提取工藝條件為A3B2C3D2,即配比為4∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶25，提取時間2 h。

2.3.3提取次數(shù)的考察

按半枝蓮∶白花蛇舌草配比為4∶1，稱取3.6g,先用石油醚超聲處理,過濾，濾渣晾干備用。將濾渣加入25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取2 h,過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，再向藥材中加入同樣體積的乙醇回流提取，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，再次重復(fù)上述操作，將3次提取液分別定容，混勻，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對藥對總黃酮提取率的影響

由圖5可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，藥對中總黃酮的提取率呈明顯的下降趨勢，但為了使藥對中的黃酮提取完全，因此選擇提取3次。

2.3.4提取工藝條件的確定

根據(jù)以上的分析結(jié)果，確定藥對中總黃酮提取的工藝條件：半枝蓮與白花蛇舌草藥對的配比為4∶1，25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，提取3次，每次2 h。

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取半枝蓮和白花蛇舌草3份，每份3.6g，先用石油醚超聲處理,過濾，濾渣晾干，備用。將濾渣按“2.3.4”項(xiàng)確定提取的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)。測得的結(jié)果表明3份藥對中總黃酮的提取率接近，平均提取率可達(dá)28.937 mg/g，RSD為0.11%，驗(yàn)證試驗(yàn)表明該提取工藝條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

2.4 聚酰胺樹脂對藥對中總黃酮的純化條件考察

2.4.1上樣溶液的制備

將半枝蓮和白花蛇舌草按配比4∶1的比例共稱取200 g，先加適量石油醚超聲處理，抽濾，藥渣晾干，再加25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取3次，每次2 h。合并提取液，回收乙醇，水溶液濃縮到適當(dāng)體積作為上樣溶液備用。

2.4.2上樣液濃度的考察

量取“2.4.1”項(xiàng)上樣液5份，每份10 ml，分別作如下處理：第一份濃縮至5 ml；第二份濃縮至7 ml；第三份保持原液體積不變，第四份加蒸餾水至14 ml，超聲混勻；第五份加蒸餾水至18 ml，超聲混勻。各量取5份聚酰胺樹脂，每份1g，置于已編號1～5號的具塞瓶中，將處理的上樣液加到具塞瓶中，每隔一段時間振搖一次，靜置12 h后抽濾，濾液加蒸餾水定容至25 ml量瓶中，混勻，各量取適量溶液蒸干，加少量甲醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，余下操作同“2.2.1”項(xiàng)，按“2.1.4”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量。結(jié)果1～5號編號的溶液的吸附量分別為：9.778、8.578、8.290、7.519、7.187 mg/g，綜合比較1號溶液的吸附量最大，溶液雖然濃縮，但沉淀不是很多，故黃酮損失量也不大，說明1號溶液靜態(tài)吸附效果較好，故選擇1號濃縮藥液濃度作為上樣液。

2.4.3上樣液pH的考察

準(zhǔn)確稱取聚酰胺樹脂5份，每份1g，置于已編號1～5號的具塞瓶。按上樣液濃度考察結(jié)果將“2.4.1”項(xiàng)制備的上樣液濃縮至一半體積，精密量取5份，加入到上述已編號的裝有聚酰胺樹脂的錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，余下操作同“2.4.2”項(xiàng)。結(jié)果1～5號溶液的吸附量分別為：10.736、10.745、10.143、9.67、9.374 mg/g，從結(jié)果可以看出 pH值為2.0、3.0、4.0時溶液的吸附量都較高，說明在酸性條件下黃酮類化合物會以分子狀態(tài)存在，吸附效果較好，但如果酸性過強(qiáng)，黃酮類化合物會轉(zhuǎn)變?yōu)辂}，重新溶解在溶液里，會導(dǎo)致吸附效果變差。綜合考慮，確定上樣液pH約為4.0。

2.4.4上樣溶液體積的考察

量取“2.4.1”項(xiàng)濃縮至一半體積的上樣液(總黃酮濃度為63.14 mg/ml)，調(diào)至pH為4.0備用。準(zhǔn)確稱取已處理好的聚酰胺樹脂8 g，裝于層析柱(徑高比為1∶10)中，將上樣液以流速1.5 ml/min上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附，收集過柱液，每管15ml，共收集13管，每管過柱液混勻后移取適量溶液蒸干，余下操作同“2.4.2”項(xiàng)。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，繪制泄漏曲線。如圖6所示。

圖6 總黃酮的泄露曲線

從圖6可以看出，上樣體積為120 ml時開始有大量的黃酮隨柱液流出，黃酮損失量逐漸增大，當(dāng)上樣體積為165 ml時基本達(dá)到飽和，為了減少黃酮類成分的過多損失，上樣溶液體積確定為120 ml相當(dāng)于7.5床容積。

2.4.5水洗脫體積的考察

量取“2.4.1”項(xiàng)濃縮至一半體積的上樣液，調(diào)至pH值為4.0，備用。準(zhǔn)確稱取已處理好的聚酰胺樹脂8g，裝于層析柱中，將上樣液以流速1.5ml/min上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完畢后，用蒸餾水洗脫，收集洗脫液，每管10 ml，共收集6管，將收集的洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，各管質(zhì)量分別為286.7、119.6、60.3、44.7、28.5、17.4 mg，結(jié)果表明隨著水洗脫體積的增大，洗脫的雜質(zhì)質(zhì)量逐漸減小，編號為5即水洗脫體積為50 ml時已基本將柱中大部分水溶性的雜質(zhì)洗脫出來。故選擇洗脫用水體積為50 ml，相當(dāng)于3.1床容積。

2.4.6洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察

將“2.4.5”項(xiàng)已上樣后的聚酰胺樹脂柱，依次用體積分?jǐn)?shù)分別為20%、35%、50%、65%、80%、95%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集各體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液依次定容至100 ml量瓶中，混勻后用移液管各移取適量蒸干，余下操作同“2.4.2”項(xiàng)。如圖7所示。

圖7 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸效果

由圖7可以看出，洗脫液中黃酮量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時洗脫量達(dá)到最大，解吸效果最好，故選擇體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇作為洗脫溶劑。

2.4.7乙醇洗脫體積的考察

量取“2.4.1”項(xiàng)濃縮至一半體積的上樣液，調(diào)至pH值為4.0，備用。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的聚酰胺樹脂8 g，裝柱，將上樣液以流速1.5 ml/min上樣，進(jìn)行動態(tài)吸附，吸附完畢后，先用3.1床容積的蒸餾水洗脫，再用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇洗脫，收集洗脫液，每管10 ml，共收集19管，各管混勻后用移液管移取適量蒸干，余下操作同“2.4.2”項(xiàng)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 乙醇不同洗脫體積的解吸效果

由圖8可以看出，洗脫液中的黃酮量隨著乙醇洗脫體積的增加呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，當(dāng)乙醇洗脫體積為150 ml 時，已能將樹脂吸附的絕大多數(shù)黃酮類成分洗脫下來，洗脫基本完全，故選擇體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇洗脫體積為150 ml，相當(dāng)于9.3床容積。

2.4.8驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取處理好的聚酰胺樹脂8 g，裝于層析柱中，量取“2.4.1”項(xiàng)濃縮至一半體積pH值為4.0的上樣液120 ml(總黃酮濃度為63.14 mg/ml)，以1.5 ml/min的流速上樣，吸附完畢后先用流速為3 ml/min的3.1床容積的水洗脫，再用流速為3 ml/min的 9.3床容積體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮、冷凍、干燥，稱重。測得總黃酮純度為40.39%，轉(zhuǎn)移率為81.57%。

3 結(jié)果與結(jié)論

①藥對中總黃酮提取的工藝條件：半枝蓮與白花蛇舌草藥對的配比為4∶1，25倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，提取3次，每次2 h。

②聚酰胺樹脂純化藥對中總黃酮的工藝條件：上樣液總黃酮濃度為63.14 mg/ml，pH 為4.0，以1.5 ml/min的流速上樣，先用流速為3 ml/min 的3.1床容積的水洗脫，再用流速為3 ml/min 的9.3床容積體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇洗脫，收集洗脫液，測得總黃酮純度為40.39%，轉(zhuǎn)移率為81.57%。

③聚酰胺樹脂對半枝蓮和白花蛇舌草藥對中總黃酮的純化效果較好，此純化方法簡單易行，可以得到較高純度的總黃酮，研究結(jié)果有良好的應(yīng)用前景。

4 討論

聚酰胺樹脂是分離純化黃酮類化合物理想的吸附劑，由于具有比表面積大，選擇性高，吸附容量大，吸附速度快，理化性質(zhì)穩(wěn)定，使用周期長，再生處理容易等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物堿類、苯丙素類、黃酮類、皂苷等天然化合物的分離、純化、富集等方面，并都取得了良好的效果[11-12]。

半枝蓮和白花蛇舌草皆屬常用中藥，在我國很早就以藥對的形式應(yīng)用于腫瘤、炎癥的治療。本研究對半枝蓮和白花蛇舌草中總黃酮進(jìn)行了較為系統(tǒng)的提取、純化研究，為后續(xù)藥對有效部位總黃酮的藥理作用進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時也為闡明半枝蓮和白花蛇舌草藥對藥理作用機(jī)理提供參考和依據(jù)。