張莉燕，宋金春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

2004年9月，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)提出將質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)理念應(yīng)用于藥品的研發(fā)和生產(chǎn)[1]；2006年，人用藥品注冊技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)Q8 指南指出，QbD是從預(yù)定義產(chǎn)品目標(biāo)開始，基于科學(xué)和風(fēng)險(xiǎn)管理的方法，加強(qiáng)對產(chǎn)品的理解及過程控制的一種系統(tǒng)的開發(fā)方法[2]?；?QbD 理念建立滿足預(yù)定義目標(biāo)且工藝穩(wěn)健的設(shè)計(jì)空間，對相關(guān)工藝參數(shù)或物料屬性的超限范圍進(jìn)行界定[3]，重點(diǎn)關(guān)注控制策略和工藝的耐用性，參數(shù)在設(shè)計(jì)空間內(nèi)變動(dòng)時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量也能保持一致。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是半胱氨酸的乙?；苌颷4]，作為對乙酰氨基酚過量的解毒劑被廣泛認(rèn)可[5]，可通過作用于谷氨酸能和多巴胺能神經(jīng)傳遞、氧化應(yīng)激、神經(jīng)發(fā)生、線粒體障礙和炎癥途徑等發(fā)揮作用[6-7]。在國內(nèi)，其注射液用于肝衰竭早期治療，以降低膽紅素、提高凝血酶原活力；但在滴注時(shí)可出現(xiàn)惡心、嘔吐、皮疹、瘙癢、支氣管痙攣、頭痛頭暈、發(fā)熱、過敏反應(yīng)等。實(shí)驗(yàn)參考Cumberland Pharmaceuticals Inc.原研制劑的處方組成，基于QbD理念對處方因素進(jìn)行優(yōu)化和選擇，保障注射液質(zhì)量。

1 儀器與試劑

CPA225D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；ZNCL-GS智能磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；BF2000氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；雷磁PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；砂芯過濾器(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SK5200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；安捷倫1100高效液相色譜儀(配有G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B-DAD檢測儀及Agilent化學(xué)工作站，美國Agilent公司)。

N-乙酰半胱氨酸原料藥(武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司)、依地酸鈣鈉(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸均為分析純；甲醇為色譜純[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；水為超純水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 定義目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量概況

通過查閱原研產(chǎn)品說明書、文獻(xiàn)信息，查詢目標(biāo)產(chǎn)品的臨床給藥特點(diǎn)、給藥途徑、劑型、規(guī)格、容器密閉系統(tǒng)等信息，進(jìn)行前瞻性的總結(jié)，定義目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量特性(guality target product profile,QTPP)[8]，如表1所示。

表1 NAC注射劑的目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況

2.2 識(shí)別產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性

注射劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)通常包括：①無菌保證；②熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素；③外源性雜質(zhì)；④注射液的穩(wěn)定性(如pH值、顏色、有關(guān)物質(zhì)、含量等)以及復(fù)溶性等[8]。NAC易氧化變色，進(jìn)行處方開發(fā)時(shí)，將注射液滅菌前后pH值的變化量及主藥含量作為關(guān)鍵評價(jià)指標(biāo)，即響應(yīng)。

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評估

根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程繪制魚骨圖篩選出影響制劑質(zhì)量的因素(圖1)，主要包括處方因素及工藝因素兩部分。

圖1 影響制劑質(zhì)量因素的魚骨圖

采用失效模式與效應(yīng)分析(FMEA)對各因素風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行定量評估[9]，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估系數(shù)值(risk priority number，RPN)確定關(guān)鍵工藝參數(shù)。RPN值是由各因素嚴(yán)重程度(S)、發(fā)生率(O)和檢測難易程度(D)的得分值相乘得到[3]，當(dāng)某參數(shù)的RPN值大于8時(shí)，則被確定為關(guān)鍵工藝參數(shù)。S、O、D評分原則及參數(shù)RPN見表2和圖2。

表2 嚴(yán)重程度(S)、發(fā)生率(O)和檢測難易程度(D)的評分原則

注：由于本試驗(yàn)中影響制劑質(zhì)量的因素或可通過儀器檢測間接評估，或?yàn)樘匦詤?shù)可直接直觀判斷(圖1、圖2)，故對于檢測難易程度(D)只設(shè)置了容易檢測到和很難被檢測到兩種情況

圖2 FMEA風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果

2.4 關(guān)鍵工藝參數(shù)

由風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果(圖2)可知，依地酸鈣鈉、pH值、配液溫度、滅菌壓力、標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間的RPN值較大，pH值由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已確定，因此，本實(shí)驗(yàn)選取依地酸鈣鈉添加量、配液溫度及滅菌條件作為影響制劑質(zhì)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

2.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對3個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)：依地酸鈣鈉添加量(A)、配液溫度(B)、滅菌條件(C)用Minitab軟件做全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以滅菌后pH值變化量(Y1)、主藥含量(Y2)為響應(yīng)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平和響應(yīng)(表3、表4)，各序列處方見表5。

2.6 注射劑的制備

量取約80%處方量的注射用水，通氮?dú)怙柡秃蠹尤胩幏搅康腘AC和不同比例的依地酸鈣鈉，在氮?dú)鈼l件下攪拌使之溶解，加入飽和NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH 為6.5～7.5，加入氮?dú)怙柡偷淖⑸溆盟撂幏搅浚?.45 μm微孔濾膜過濾，檢查濾液澄明度后灌封，通氮?dú)庥谏喜靠臻g，滅菌后燈檢，按照規(guī)定方法進(jìn)行可見異物檢查，合格樣品即為成品。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平表

表4 相應(yīng)目標(biāo)值與可接受范圍

表5 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.7 分析方法

2.7.1色譜條件

色譜柱：Wondasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(濃磷酸調(diào)節(jié)pH至2.15)-甲醇(90:10，V/V)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.7.2 對照品溶液的制備

取NAC對照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成0.08 mg/ml的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣。

2.7.3供試品溶液的制備

量取制備的NAC注射劑適量，加流動(dòng)相制成2 mg/ml的溶液，再精密量取上述溶液適量，加流動(dòng)相制成0.08 mg/ml的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣。

2.7.4線性關(guān)系考察

制備不同濃度的NAC對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，以NAC對照品峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)作圖，進(jìn)行線性回歸，得NAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 14 679X-99.267，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

3 結(jié)果

3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

按表5設(shè)計(jì)的試驗(yàn)順序進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表6。對結(jié)果進(jìn)行分析，各響應(yīng)的因子效應(yīng)圖見圖3、圖4，方差分析結(jié)果見表7。

因子效應(yīng)圖表明，因子A、B、C及其相互作用產(chǎn)生的復(fù)合因子AB、AC、BC均對響應(yīng)Y1、Y2有顯著影響。相關(guān)性好的模型R2應(yīng)大于0.8，本試驗(yàn) Y1、Y2模型的R2分別為0.994 0和0.989 0，且與R2(調(diào)整)接近，表明回歸模型對試驗(yàn)擬合較好，可以信賴；Y1、Y2模型彎曲P值大于0.05，表明模型不存在彎曲；失擬P值大于0.05，表明不存在更高階的相互作用，構(gòu)建模型合適。

表6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

圖3 Y1因子效應(yīng)圖(α=0.05) A.標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖；B.標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的正態(tài)圖

圖4 Y2因子效應(yīng)圖(α=0.05) A.標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖；B.標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的正態(tài)圖

來源模型P值彎曲P值失擬P值R2(%)R2(調(diào)整)(%)Y1全模型0.0000.8790.45299.4098.51Y2全模型0.0010.8060.24398.9097.25

注：a=0.05

表8 NAC設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證結(jié)果

由圖5可見，殘差均在正常范圍內(nèi)，且滿足正態(tài)分布，最終得到響應(yīng)Y1、Y2的回歸方程：

Y1=0.419 09+0.112 50A+0.050 00 B+0.067 50C+0.042 50AB-0.080 00AC+0.167 50 BC

Y2=105.234-3.826A-1.456B-1.499C-1.351AB+3.856AC-4.934BC

從輸出的Y1、Y2等值曲線圖(圖6)可見，較淺區(qū)域的響應(yīng)更滿足要求，對響應(yīng)進(jìn)行疊加得到等值曲線疊加圖(圖7)，確定可接受范圍。圖中白色區(qū)域?yàn)榭尚袇^(qū)域，即建立的設(shè)計(jì)空間。最后運(yùn)用響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行優(yōu)化，如圖8所示，A、B、C因素分別從低水平變化到高水平時(shí)，兩個(gè)響應(yīng)的變化趨勢相反；由預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已知注射液最適合的pH值在6.5～7.5，雖然注射液滅菌前后的pH值變化較大，但仍處于上述范圍內(nèi)，故對響應(yīng)Y2給予更多的關(guān)注。將Y2和Y1的權(quán)重比調(diào)至9:1進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，復(fù)合合意性為0.7269，表明兩個(gè)響應(yīng)均獲得較好的結(jié)果，從而得出最佳工藝參數(shù)：依地酸鈣鈉添加量(A)為0.049 192%，配液溫度(B)為60℃，滅菌條件(C)為116℃，40 min。

3.2 設(shè)計(jì)空間的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)空間的可靠性，選擇空間內(nèi)的點(diǎn)(0.5，0.0)，即依地酸鈣鈉添加量為0.045%，配液溫度為50℃，滅菌條件為116℃， 40 min進(jìn)行驗(yàn)證，平行3次測定，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值相近，表明建立的模型具有較好的預(yù)測能力，且在設(shè)計(jì)空間內(nèi)改變生產(chǎn)工藝和參數(shù)時(shí)能保證制劑質(zhì)量的均一可控。

圖5 Y1、Y2殘差圖 A.Y1殘差正態(tài)概率圖；B. Y1殘差直方圖；C.Y2殘差正態(tài)概率圖；D. Y2殘差直方圖

圖6 Y1、Y2等值曲線圖 A.Y1與B(t/℃)、A(依地酸鈣鈉)的等值線圖；B.Y2與B(t/℃)、A(依地酸鈣鈉)的等值線圖

圖7 Y1、Y2等值曲線疊加圖

圖8 多響應(yīng)優(yōu)化圖

4 討論

本實(shí)驗(yàn)參考Cumberland Pharmaceuticals Inc.原研制劑處方組成，基于QbD理念，開發(fā)了穩(wěn)定性好、致敏性低的注射液。繪制魚骨圖結(jié)合FMEA法進(jìn)行因子風(fēng)險(xiǎn)評估，確定了依地酸鈣鈉添加量、配液溫度及滅菌條件作為影響制劑質(zhì)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)；通過析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)研究了CPPs對響應(yīng)的影響，最終得到最佳工藝參數(shù)及設(shè)計(jì)空間，且驗(yàn)證空間結(jié)果與預(yù)測值接近。按照QbD理念設(shè)計(jì)的注射液，其工藝參數(shù)在設(shè)計(jì)空間內(nèi)變化時(shí)，質(zhì)量仍能保持均一穩(wěn)定，從而保障了藥品質(zhì)量。