趙穎　王雙節(jié)　柳穎　焦沙沙　鄒茹冰　方一畫　郭逸蓉　朱國念

摘 要 以醛基修飾的載玻片為固相載體，農(nóng)藥競爭抗原為包被抗原，膠體金為標(biāo)記材料，抗農(nóng)藥單克隆抗體為識別元件，銀增強(qiáng)試劑用于放大信號，建立了一種含有10對包被抗原與農(nóng)藥抗體組合的免疫芯片，可同時檢測農(nóng)產(chǎn)品中毒死蜱、三唑磷、克百威、噻蟲啉、吡蟲啉、多菌靈、異菌脲、涕滅威、甲氰菊酯和百菌清共10種農(nóng)藥。對膠體金標(biāo)記探針、包被抗原與農(nóng)藥抗體組合等免疫芯片反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。本方法對10種農(nóng)藥的檢出限（IC20）達(dá)到1.49～15.72 μg/L，檢測僅需1.5 h。將此芯片方法應(yīng)用于水果（蘋果）、蔬菜（黃瓜）以及茶葉（紅茶）中的10種農(nóng)藥殘留檢測，其最低檢出量可滿足相應(yīng)作物中的農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）檢測要求，且此芯片檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，農(nóng)藥的添加回收率為82.1%～120.8%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤10.4%， 批間RSD≤12.1%，與質(zhì)譜儀檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)大于0.9591。本研究為農(nóng)藥多殘留快速檢測分析提供了技術(shù)支持，具有良好的實用價值。

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥多殘留; 快速檢測; 免疫芯片; 膠體金; 競爭反應(yīng)

1 引 言

發(fā)展食品中農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)，對保障食品安全和消費(fèi)者健康、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義。常用的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)為色譜法、質(zhì)譜法等儀器方法[1～6]，準(zhǔn)確率高，可實現(xiàn)定性與定量分析，但其耗時長、檢測成本高，對檢測人員技能要求高，而農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)可以彌補(bǔ)這些不足。常見農(nóng)藥殘留快速檢測方法包括酶抑制法和免疫分析方法。其中，酶抑制法已列入國家標(biāo)準(zhǔn)，但其檢測對象僅限于有機(jī)磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑，這兩類農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已較少使用，因而存在一定的局限性。免疫分析方法主要基于抗原抗體反應(yīng)，其檢測的農(nóng)藥范圍比酶抑制法更寬，檢測快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高。

常見的免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫側(cè)流層析試紙法。Liu等[7]建立了間接競爭性ELISA定量檢測果蔬中苯醚甲環(huán)唑的方法，最低檢出量達(dá)229 μg/kg; Ma等[8]建立了ELISA法檢測蜂蜜樣品中的吡蟲啉和噻蟲嗪殘留，最低檢出量為20 μg/kg 和5 μg/kg; Chen等[9]建立了量子點-鏈霉親和素偶聯(lián)物快速靈敏競爭熒光ELISA方法，用于飲用水中毒死蜱檢測，靈敏度較常規(guī)ELISA提高了5.5倍。對于ELISA法，一種試劑盒通常只能檢測一種或兩種農(nóng)藥。隨著膠體金、量子點、熒光微球等多種納米材料被適為標(biāo)記物，試紙免疫側(cè)流層析法在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用研究日益增多[10]。Liu等[11]將膠體金試紙技術(shù)， 用于三唑磷和對硫磷農(nóng)藥檢測，檢測靈敏度分別為50和100 μg/L; Wang等[12]將量子點試紙技術(shù)應(yīng)用于吡蟲啉、氯噻啉、噻蟲胺農(nóng)藥檢測，檢出限為0.10～0.33 μg/L; Zhang等[13]將時間分辨免疫層析技術(shù)用于檢測克百威，檢出限達(dá)0.04～0.76 μg/L。雖然免疫層析試紙的制備成本低，便于攜帶，現(xiàn)場檢測方便，但由于其空間局限性，一條試紙不易設(shè)置5條以上的測試線[14]，故一般檢測農(nóng)藥的種類小于5種[15]。因此，亟需研發(fā)能實現(xiàn)更多種農(nóng)藥殘留同時快速定性與定量檢測的分析方法。

免疫芯片是以抗原-抗體特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的蛋白芯片，是將幾個、幾十個甚至更高通量的抗原或抗體微量化， 以點陣式高密度排列于載體芯片，通過特異性免疫反應(yīng)捕獲待測樣品中的靶分子，檢測靶分子的含量[16]。免疫芯片技術(shù)已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的疾病診斷、蛋白質(zhì)功能鑒定、微生物致病菌鑒定方面，并逐漸拓展到環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生與質(zhì)量安全控制等方面[17]。近年來，免疫芯片技術(shù)已被用于小分子污染物的檢測中，主要采用固定包被抗原的競爭免疫反應(yīng)模式，使用的芯片載體有瓊脂糖玻片、醋酸纖維膜和CD光盤，檢測對象有獸藥[18]、真菌毒素[19]、農(nóng)藥[20，21]等，但目標(biāo)測試物通常不超過10種，且大都局限于環(huán)境水樣的檢測，尚未將免疫芯片技術(shù)應(yīng)用于畜產(chǎn)品、農(nóng)產(chǎn)品等復(fù)雜基質(zhì)樣本。 這可能是由于復(fù)雜樣品基質(zhì)對不同抗原-抗體反應(yīng)的干擾程度不同，當(dāng)多個免疫反應(yīng)同時在均相統(tǒng)一的體系條件下進(jìn)行，會影響個別反應(yīng)的靈敏度，或者部分抗原-抗體有交叉識別現(xiàn)象。因此，目前關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留檢測免疫芯片技術(shù)的報道較少。本課題組前期建立的基于金增強(qiáng)的間接競爭免疫芯片技術(shù)用于檢測蔬果中呋喃丹等7種農(nóng)藥[22]，采用QuEChERS方法進(jìn)行樣品提取與凈化，從而降低基質(zhì)干擾，但該研究采用硝酸纖維膜為非共價結(jié)合吸附載體，包被抗原固定程度易受反應(yīng)體系（如pH值、鹽離子強(qiáng)度）的影響，且漂洗過程存在膜易破損、不便操作等缺點。

本研究選擇玻片為載體，在其表面進(jìn)行醛基修飾，將包被抗原以共價鍵結(jié)合固定于載體上，更加穩(wěn)定，并建立了毒死蜱等10種常見農(nóng)藥多殘留的免疫芯片檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）; PHS-3C pH計（上海雷磁環(huán)保工程公司）; Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）; Allegra 64R臺式高速離心機(jī)（美國Beckman公司）; GB500-X芯片點樣儀（愛爾蘭PolyPico Technologies公司）; 圖像掃描儀（日本EPSON公司）; Analysis Only 4100芯片數(shù)據(jù)分析軟件（美國GenePix Pro公司）; Agilent 7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC-MS/MS，美國Agilent公司）; 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS，美國Waters公司）。

氯金酸、檸檬酸三鈉、N-羥基丁二酰亞胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亞胺、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、銀增強(qiáng)液A和銀增強(qiáng)液B、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、鄰苯二胺（OPD）、N-丙基乙二胺（PSA） （美國Sigma-Aldrich公司），其它試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）。脫脂奶粉（上海光明乳業(yè)公司）; 8 mg/mL羊抗鼠IgG（二抗，上海捷寧生物公司）; 瓊脂糖（北京Solarbio公司）; 芯片圍欄（北京博奧生物公司）; 載玻片（浙江同力信息科技公司）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ cm）。

毒死蜱、三唑磷、甲氰菊酯、克百威、噻蟲啉、吡蟲啉、百菌清、多菌靈、涕滅威、異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL， 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院天津環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）; 百菌清、多菌靈、涕滅威、異菌脲的包被抗原和農(nóng)藥相應(yīng)的抗體購于無錫杰圣杰康生物科技有限公司，其它包被抗原和農(nóng)藥相應(yīng)的抗體由本實驗室制備。

蘋果、黃瓜、紅茶樣品購于本地超市。

2.2 醛基玻片制備

載玻片先用超純水清洗，再將其完全浸沒于食人魚刻蝕液（98% H2SO4-30% H2O2=3∶1，V/V）， 80℃處理40 min， 然后用超純水清洗3次，氮氣吹干。

將氨基硅烷化后的玻片放入含3%～4%（V/V） 戊二醛的磷酸鹽緩沖溶液（PBS， 0.01 mol/L，pH 7.4）中，室溫下浸泡2 h，取出后先用PBS清洗3次，然后用超純水漂清洗3次，氮氣吹干，于4℃干燥保存，備用。

2.3 膠體金及金標(biāo)二抗探針的制備

以金標(biāo)二抗為信號探針，采用經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原法制備20 nm 膠體金[23]用于標(biāo)記二抗。采用鹽沉淀法和吸光度法，進(jìn)行膠體金標(biāo)記體系pH值和最適標(biāo)記量優(yōu)化[24]。在二抗標(biāo)記濃度為80 mg/L條件下，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，篩選最適標(biāo)記pH值; 在最適pH條件下，進(jìn)行膠體金最適標(biāo)記量優(yōu)化，分別設(shè)置10、20、40、80和100 mg/L的二抗標(biāo)記濃度，篩選最適標(biāo)記量。按照文獻(xiàn)[24]的方法，在最適條件下，制備金標(biāo)二抗探針。

2.4 芯片點樣與檢測方法

（1）點樣 將各農(nóng)藥包被原用30%甘油-0.05 mol/L CBS （pH 9.6）緩沖液稀釋后，用微量點樣儀點樣包被于醛基化玻片上（3 nL/點，冷凍干燥 2 h），10種農(nóng)藥包被抗原在醛基玻片上的排布陣列如圖1所示; （2）芯片圍欄分區(qū) 將芯片圍欄黏貼在相應(yīng)的區(qū)域，0.05% Tween-20-0.01 mol/L PBS （PBST）洗滌2次; （3）封閉 5%脫脂奶粉-PBS，100 μL/孔，37℃ 孵育30 min，PBST洗滌2次; （4）一抗反應(yīng) 加入抗體和待測樣品（農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品或水果、蔬菜、茶葉等提取液）， 10種抗體稀釋液和待測樣品各25 μL/孔， 振蕩混勻后，37℃孵育30 min， PBST洗滌2次; （5）金標(biāo)二抗反應(yīng) 加入金標(biāo)二抗20倍稀釋液（100 μL/孔），37℃孵育30 min，用PBST和超純水各洗滌1次; （6）銀增強(qiáng)反應(yīng) 加入銀增強(qiáng)A液和B液等體積混合液，100 μL/孔，室溫孵育15 min，超純水洗滌2次; （7）芯片掃描 將芯片置于圖像掃描儀進(jìn)行掃描成像，用Adobe photoshop 7.0.1生成16位灰度圖，將所得圖片置于芯片數(shù)據(jù)分析軟件中獲得每個檢測區(qū)域的信號值，用于定量計算; （8）數(shù)據(jù)分析 采用芯片數(shù)據(jù)分析軟件計算每個檢測點的信號值和背景值，扣除背景值后得到相對信號值。抑制率（Inhisition rate （%））的計算見公式（1）：

I（%）={（S_b-S_s）/S_b}×100%（1）

其中，I為抑制率， S_b為空白樣品的信號值; S_s為檢測樣品的信號值。

以抑制率為縱坐標(biāo)，農(nóng)藥濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算抑制率IC₅₀。

2.5 實際樣品分析

用甲醇將毒死蜱等10種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，將農(nóng)藥混合標(biāo)樣分別添加于黃瓜、蘋果、紅茶空白樣品（經(jīng)質(zhì)譜儀檢測，毒死蜱等10種農(nóng)藥的初始?xì)埩袅烤∮趦x器檢測限）中。

芯片檢測：采用簡化的QuEChERS法[21]對待測樣品進(jìn)行快速前處理。稱取水果、蔬菜樣品10 g（茶葉樣品 1 g，加入10 mL超純水浸泡10 min），加入10 mL乙腈，振蕩提取3 min，加入1 g NaCl和5 g無水MgSO4，振蕩提取3 min，4000 r/min離心5 min。取5 mL上清液，加入0.1 g PSA，靜置30 min后，吸取 2 mL 上清液，氮氣吹干，用反應(yīng)緩沖液（20%甲醇-PBS）定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜后待測。采用2.4節(jié)的方法進(jìn)行測定。

儀器檢測：黃瓜、蘋果和紅茶樣品中10種農(nóng)藥殘留的前處理與檢測方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T761-2008[25]，其中噻蟲啉、多菌靈、吡蟲啉和涕滅威4種農(nóng)藥用UPLC-MS/MS檢測，其余6種農(nóng)藥用GC-MS/MS檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 芯片的包被抗原與農(nóng)藥抗體工作濃度優(yōu)化

采用10組包被抗原-農(nóng)藥抗體組合，分別為毒死蜱-OVA，三唑磷-OVA，克百威-OVA，噻蟲啉-OVA，吡蟲啉-HRP，多菌靈-BSA，異菌脲-BSA，涕滅威-BSA，甲氰菊酯-BSA，百菌清-BSA和相應(yīng)的農(nóng)藥抗體組合，一個陣列組合中包含以上10種包被抗原，一張玻片包含7個陣列組合。免疫芯片反應(yīng)過程如圖2所示。

為實現(xiàn)各組包被原-抗體反應(yīng)均獲得較高的信號響應(yīng)、靈敏度和特異性，根據(jù)芯片檢測點的掃描分析數(shù)據(jù)，最終確定芯片中包被抗原-農(nóng)藥抗體工作濃度。其中，包被抗原在免疫芯片上的點樣濃度為0.02～1.00 g/L， 一抗?jié)舛葹?.20～5.00 mg/L; 將50 mg/L二抗用于膠體金標(biāo)記，反應(yīng)時金標(biāo)探針稀釋20倍。優(yōu)化得到包被抗原-農(nóng)藥抗體組合濃度見表1。

3.2 免疫芯片方法的分析性能

采用10種農(nóng)藥的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試，通過芯片掃描儀成圖并獲取信號值進(jìn)行定量分析，得出10種農(nóng)藥的抑制中濃度（IC₅₀）、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（R2>0.96）和線性范圍見表2，芯片測試掃描圖見圖3。

結(jié)果表明，以醛基玻片為固相載體構(gòu)建的免疫芯片方法，對各農(nóng)藥的IC₅₀與采用同樣包被抗原和農(nóng)藥抗體建立的間接競爭ELISA方法對各農(nóng)藥的IC₅₀相當(dāng)，且接近于本研究組前期建立的膜芯片法[22]。本方法以IC₂₀為檢出限，以黃瓜中毒死蜱農(nóng)藥殘留為例，其IC₂₀=1.31 μg/L，黃瓜樣品提取需要10倍稀釋，則理論最低檢出量為13.1 μg/kg，可滿足黃瓜中毒死蜱最大殘留限量100 μg/kg的檢測要求[26，27]; 同理，其它9種農(nóng)藥的最低檢出量也可滿足黃瓜中MRL檢測要求。

3.3 樣品的基質(zhì)效應(yīng)

免疫芯片用于檢測蘋果、黃瓜、紅茶樣品中的10種農(nóng)藥，需首先考察樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾程度，通常采用樣品稀釋法降低基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用簡化的QuEChERS法對待測樣品進(jìn)行提取、凈化、濃縮和定容，根據(jù)最終定容體積可計算出樣品基質(zhì)的稀釋倍數(shù)。設(shè)置樣品稀釋系列梯度（1、10、20和40倍），進(jìn)行各基質(zhì)不同稀釋倍數(shù)下的10種農(nóng)藥的芯片法檢測，實驗結(jié)果表明，黃瓜樣品稀釋10倍，蘋果和茶葉樣品稀釋20倍，其基質(zhì)干擾可忽略，不影響方法的檢出限。因而，樣品提取凈化后取2 mL上清液，氮氣吹干，黃瓜樣品采用20 mL的反應(yīng)緩沖液定容（10倍稀釋），蘋果和茶葉樣品采用40 mL的反應(yīng)緩沖液定容（20倍稀釋）。以蔬菜樣品（黃瓜）為例，其添加回收率及批內(nèi)批間差異見表3。蘋果、黃瓜、紅茶樣品的添加回收率為82.1%～120.8%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%～14.8%，批間RSD為3.6%～12.1%，表明基于醛基玻片的農(nóng)藥多殘留檢測方法具備良好的準(zhǔn)確度和精確度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求，且檢測靈敏度符合3種農(nóng)產(chǎn)品的MRL要求（MRL數(shù)值見電子版文后支持信息中附表）。

3.4 芯片法與儀器法檢測結(jié)果的相關(guān)性

分別使用免疫芯片方法和液（氣）相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器方法檢測蘋果、黃瓜、紅茶樣品上10種農(nóng)藥添加回收量（表3）， 將兩種檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，得到線性回歸方程，蘋果： y=1.0419x-0.9035，R2=0.9730; 黃瓜： y=1.0037x+2.4689， R2=0.9741; 紅茶： y=1.0046x+7.2808， R2=0.9591。 結(jié)果表明，免疫芯片分析方法和質(zhì)譜分析方法對10種農(nóng)藥的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，兩種檢測方法對黃瓜樣品檢測的相關(guān)性曲線見圖4。

4 結(jié) 論

建立了農(nóng)藥多殘留免疫芯片檢測體系，并應(yīng)用于三類農(nóng)作物和水果（蘋果）、蔬菜（黃瓜）、茶葉（紅茶）中毒死蜱等10種常見農(nóng)藥殘留的快速篩查，而且有望應(yīng)用于其它農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測。與傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留儀器檢測方法相比，此芯片方法具有成本低、前處理方法簡單、檢測快速、檢測農(nóng)藥種類相對較多等優(yōu)勢。

References

1 ZHOU Li， LUO Fen-Jian， ZHANG Xin-Zhong， JIANG Ya-Ping， LUO Zheng-Yun， LIU Guang-Ming， CHEN Zong-Mao. Journal of Instrumental Analysis， 2014， 33（6）： 642-647

周 利， 羅逢健， 張新忠， 姜亞萍， 樓正云， 劉光明， 陳宗懋. 分析測試學(xué)報， 2014，? 33 （6）： 642-647

2 ZHU Pan， MIAO Hong， DU Juan， ZHAO Yun-Feng， WU Yong-Ning. Journal of Food Safety and Qualityy，? 2013，? 4（1）： 3-10

朱 盼， 苗 虹， 杜 娟， 趙云峰， 吳永寧.? 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，? 2013，? 4 （1）： 3-10

3 LIU Yong-Qiang， LIU Sheng， XU Wen-Juan， TIAN Guo-Ning， ZHANG Jin-Ling. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（9）： 941-948

劉永強(qiáng)， 劉 勝， 許文娟， 田國寧， 張金玲. 色譜， 2017， 35（9）： 941-948

4 LIANG Xiu-Mei， WANG Xiang-Yun， XUE Xiao-Feng， QI Pei-Pei， LIU Zhen-Zhen， LIU Zhi-Wei， ZHOU Li， WANG Xin-Quan， WANG Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（4）： 553-559

梁秀美， 王祥云， 薛曉鋒， 齊沛沛， 劉真真， 劉之煒， 周 莉， 王新全， 王 強(qiáng). 分析化學(xué)， 2017， 45（4）： 553-559

5 QU Li， LI You， ZENG Jing， SHENG Yong-Gang， YI Xiong-Hai， CHENG Jia. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（7）： 778-784

曲 栗， 李 優(yōu)， 曾 靜， 盛永剛， 伊雄海， 程 甲. 色譜， 2017， 35（7）： 778-784

6 GAO Yang， XU Ying-Ming， SUN Yang， QIN Xu. Journal of Agricultural Resources and Environment，? 2014，? 31（2）： 110-117

高 陽， 徐應(yīng)明， 孫 揚(yáng)， 秦 旭.? 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報，? 2014，? 31（2）： 110-117

7 Liu B， Feng J H， Sun X， Sheng W， Zhang Y， Wang S. Food Anal. Method， 2018，? 11（1）： 119-127

8 Ma H X， Xu Y J， Li Q X， Xu T， Wang X T， Li J. Food Addit. Contam. A， 2009，? 26： 713-718

9 Chen Y P， Ren H L， Liu N， Sai N， Liu X Y， Liu Z， Gao Z X， Ning B A. J. Agric. Food Chem.， 2010，? 58（16）： 8895-8903

10 SI Fang-Fang， GUO Yi-Rong， ZHAO Ying， GUI Wen-Jun， WANG Meng-Cen， ZHU Guo-Nian. Chinese Journal of Pesticide Science， 2017，? 19（4）： 409-417

司芳芳， 郭逸蓉， 趙 穎， 桂文君， 王蒙岑， 朱國念.? 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，? 2017，? 19（4）： 409-417

11 Liu B B， Gong H， Wang Y L， Zhang X S， Li P， Qiu Y L， Wang L M， Hua X D， Guo Y R， Wang M H， Liu F Q， Liu X J， Zhang C Z. Anal. Methods， 2018，? 10（4）： 422-428

12 Wang S J， Liu Y， Jiao SS， Zhao Y， Guo Y R， Wang M C， Zhu G N. J. Agric. Food Chem.， 2017，? 65（46）： 10107-10114

13 Zhang Q， Qu Q Y， Chen S S， Liu X W， Li P W. Food Chem.， 2017，? 231： 295-300

14 Dzantiev B B， Byzova N A， Urusov A E， Zherdev A V. TrAC-Trend. Anal. Chem.， 2014，? 55： 81-93

15 LIU Fu-Xin， DOU Xiao-Wen， YANG Zhi-Xin， LI Qian， LUO Jiao-Yang， FAN Zhuo-Wen， YANG Mei-Hua. China Journal of Chinese Materia Medica， 2017，? 42（16）： 3056-3064

劉復(fù)新， 豆小文， 楊志欣， 李 倩， 駱驕陽， 范卓文， 楊美華.? 中國中藥雜志，? 2017，? 42（16）： 3056-3064

16 KANG Xi-Xiong. Qilu Medical Examination， 2005，? （06）： 1-3

康熙雄.? 齊魯醫(yī)學(xué)檢驗，? 2005，? （06）： 1-3

17 HUANG Qiang-Li， MIN Cheng-Jun， FAN Qiang-Sheng， WEI Xing-Hua. Meat Industry， 2013，? （02）： 46-48

黃強(qiáng)力， 閔成軍， 凡強(qiáng)勝， 魏星華. ?肉類工業(yè)，? 2013，? （02）： 46-48

18 Gao Z X， Liu N， Cao Q L， Zhang L， Wang S Q， Yao W， Chao F H. Biosens. Bioelectron.， 2009，? 24（5）： 1445-1450

19 Wang Y， Liu N， Ning B A， Liu M， Lv Z Q， Sun Z Y， Peng Y， Chen C C， Li J W， Gao Z X. Biosens.Bioelectron， 2012， ?34（1）： 44-50

20 Dobosz P， Morais S， Bonet E， Puchades R， Maquieira A. Anal. Chem.， 2015，? 87（19）： 9817-9824

21 Desmet C， Blum L J， Marquette C A. Anal. Chem.， 2012，? 84（23）： 10267-10276

22 Lan M J， Guo Y R， Zhao Y， Liu Y， Gui W J， Zhu G N. Anal. Chim. Acta， 2016，? 938： 146-155

23 ZHAO Ying， YANG Bin， LIU Ying， FANG Yi-Hua， SI Fang-Fang， GUO Yi-Rong， CHENG Jing-Li， ZHU Guo-Nian. Chinese Journal of Pesticide Scienc， 2016，? 18（3）： 337-343

趙 穎， 楊 斌， 柳 穎， 方一畫， 司芳芳， 郭逸蓉， 程敬麗， 朱國念.? 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，? 2016，? 18（3）： 337-343