張小平 趙信科 李長天 劉永琦 王碧瑩 岳曉華 孫少伯 羅露露 謝曉蓉

【摘?要】?目的： 觀察地龍降壓膠囊對慢性間歇低氧高血壓大鼠的影響。方法： 40只SD雄性大鼠隨機分成5組，分為空白對照組、慢性間歇低氧組、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊低劑量組、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊中劑量組、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊高劑量組。慢性間歇低氧大鼠在低壓氧艙內(nèi)，每天8h給予間歇低氧循環(huán)干預(yù)2周，同時使用地龍降壓膠囊進(jìn)行干預(yù)后檢測相關(guān)酶的含量，免疫組化和Western blot分別檢測心肌組織和心肌細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)情況。結(jié)果：地龍降壓膠囊對慢性間歇低氧誘發(fā)的大鼠血壓升高有明顯改善作用，心肌組織和心肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)以及乳酸脫氫酶（LDH）含量比間歇低氧大鼠組顯著降低。結(jié)論： 地龍降壓膠囊可能通過改善組織缺氧而防止慢性間歇低氧誘發(fā)的大鼠血壓升高。

【關(guān)鍵詞】?地龍降壓膠囊;慢性間歇低氧高血壓;低氧誘導(dǎo)因子-1α

【中圖分類號】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A?【文章編號】1007-8517（2019）17-0016-04

Abstract： Objective To observe the effect of Dilong antihypertension capsule on intermittent hypoxic hypertensive rats. Methods Forty SD male rats were randomly divided into five groups： Control group， chronic intermittent hypoxia group， chronic intermittent hypoxia + low dose of Dilong antihypertension capsule group， chronic intermittent hypoxia + medium dose of Dilong antihypertension capsule group， chronic intermittent hypoxia+high dose of Dilong antihypertension capsule group. Rats in chronic intermittent hypoxia group were given intermittent hypoxic circulation intervention for 2 weeks 8 hours a day in a hypobaric oxygen chamber， accompanied with the treatment of Dilong antihypertension capsules. After the administrations，the related enzymes were checked，immunohistochemistry and western blot were used to detect the expression of HIF-1α in myocardial tissue and myocardial cells respectively. Results Dilong antihypertension capsules could prevent the rise of rats blood pressure induced by chronic intermittent hypoxia， the content of LDH and the expressions of HIF-1alpha in myocardial tissue and myocardial cells of Dilong antihypertension capsules-treated rats were significantly lower than that in intermittent hypoxia rats. Conclusion Dilong antihypertension capsule could attenuate the rise of rats blood pressure induced by chronic intermittent hypoxia though improving tissue oxygen carrying capacity.

Key?words：Dilong Antihypertension Capsule; Chronic Intermittent Hypoxia Hypertension; Hypoxia-inducible Factor-1α

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleepapnea hypopnea syndrom，OSAHS）患者睡眠過程中會反復(fù)出現(xiàn)氣道阻塞及呼吸中斷、睡眠期間反復(fù)短暫缺氧為主要生理特征，研究已經(jīng)證實間歇性低氧可以誘發(fā)持續(xù)的繼發(fā)性血壓升高，是高血壓發(fā)病的獨立危險因素之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，模擬患者的慢性間歇低氧模式可導(dǎo)致大鼠持續(xù)性血壓升高[2]，證明慢性間歇缺氧可以導(dǎo)致高血壓發(fā)生。蚯蚓俗稱地龍，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載地龍具有通絡(luò)、活血化瘀的功效。本研究試圖通過觀察地龍?zhí)崛∥锏佚埥祲耗z囊是否能夠通過促進(jìn)血液循化改善慢性間歇低氧誘發(fā)高血壓大鼠的心肌缺氧，進(jìn)而探討地龍降壓膠囊臨床治療高血壓的機制。

1?材料和方法

1.1?材料?8周齡SPF級SD大鼠，平均體重 230g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供;低壓氧艙 FLYDWC 50-IIA（貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司）;地龍降壓膠囊（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，生產(chǎn)批號：151026）;鼠儀BP-98A智能血壓計（北京軟隆生物技術(shù)有限公司）。超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2?方法

1.2.1?間歇低氧高血壓模型建立?SD雄性大鼠40只隨機分成5組，每組8只，分為空白對照組（UC組，正常飼養(yǎng)）、慢性間歇低氧組（CIH組）、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊低劑量組（CIH+lowDL組）、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊中劑量組（CIH+midDL組）、慢性間歇低氧+地龍降壓膠囊高劑量組（CIH+highDL組）。根據(jù)文獻(xiàn)[3-4]建立慢性間歇低氧高血壓模型：在低壓氧艙內(nèi)，每天8 h給予間歇低氧循環(huán)干預(yù)（ 6%～8% 的O2 40 s，隨之21% 的O2 80 s），共2周。

1.2.2?給藥及血壓測量?地龍降壓膠囊干預(yù)組用地龍降壓膠囊溶于37℃溫水灌胃每日3次：每次低劑量組25mg/kg體重、中劑量組50mg/kg體重、高劑量組100mg/kg體重。對照組及模型組給予等體積的蒸餾水灌胃。大鼠心率平穩(wěn)時用智能無創(chuàng)血壓計套尾測量大鼠的尾動脈收縮壓（SBP）。

1.2.3?大鼠心肌組織HIF-1α免疫組化染色?石蠟切片用梯度酒精脫蠟，PBS洗滌兩次后， 0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓（125℃·103KPa）修復(fù)15 min，自然冷卻后，0.02 MPBS洗3min×3次，用3%過氧化氫孵育使內(nèi)源性過氧化物酶失活，洗滌。37℃下兔血清封閉20min，洗滌后加HIF-1α單克隆抗體（1∶400，武漢博士德公司） 濕盒4 ℃孵育過夜。洗滌后滴加maxvision二抗室溫30min，洗滌后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片，顯微鏡拍照。最后在 200 倍光鏡下，隨機選取5個視野，使用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析和平均光密度（MOD）值測定。

1.2.4?Western blot檢測心肌細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平?大鼠心肌組織加液氮研缽研磨后，加入4 ℃預(yù)冷的組織裂解液（樣品∶組織裂解液=1∶6重量比）處理20min后，超聲破碎，離心，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。95 ℃水浴變性后每孔上樣20μg，12%分離膠、5%濃縮膠SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜（40min），4 ℃下 5%脫脂奶粉封閉2h。加一抗（HIF-1α∶1∶300;GAPDH∶1∶1000）4°C孵育過夜，TBST洗膜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000）室溫孵育2h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，Bio-Rad凝膠成像儀成像， Bandscan 5.0 軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.5?相關(guān)酶指標(biāo)的測定?水合氯醛麻醉后，心臟取血 5 mL，室溫靜置30 min， 3000 r /min離心5 min，吸取血清，液氮保存。按試劑盒說明檢測乳酸脫氫酶（LDH）、過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）的活性。

2?結(jié)果

2.1?大鼠血壓的變化?血壓監(jiān)測的結(jié)果表明，第0天各組大鼠尾動脈收縮壓沒有明顯差異，第7天CIH 組SBP 比間歇性低氧前顯著升高[（120.83±17.79） vs（149.39±13.81） mmHg， P<0.05]，CIH+lowDL組、CIH+midDL組、CIH+highDL組也均有不同程度的升高，相對而言，高劑量地龍降壓膠囊干預(yù)組升高幅度較小。干預(yù)第14天，相對于UC組，CIH 組和CIH+lowDL組大鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的高血壓狀態(tài)（P<0.05）;和CIH 組相比，中、高劑量地龍降壓膠囊干預(yù)一定程度上防止了血壓的升高（P<0.05）。見表1。

2.2?大鼠心肌組織HIF-1α的表達(dá)的影響?使用Image-ProPlus 6.0軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析和平均光密度（MOD）值測定，結(jié)果見圖1、表2。與空白對照組相比，間歇低氧能導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)的顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，高劑量和中劑量地龍降壓膠囊能明顯降低HIF-1α的表達(dá)（P<0.05）。見表2。

2.3?對心肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)的影響?Western blot檢測心肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，UC組表達(dá)非常輕微，幾乎檢測不到，CIH組HIF-1α的表達(dá)量比UC組明顯增加（P<0.01），地龍降壓膠囊干預(yù)后，HIF-1α的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降，高劑量組下降最為明顯，是CIH組的0.57倍（P<0.05），中、低劑量組分別是CIH組表達(dá)量的0.73、0.89倍。如圖2所示。

2.4?對大鼠心肌LDH、SOD和GSH-PX 酶活性的影響?和UC組相比，CIH組SOD及GSH-PX的含量下降，而LDH含量升高。地龍干預(yù)后， 干預(yù)組LDH 活性比CIH組明顯下降（P<0.05，表3），SOD和GSH-PX 的變化不明顯（P>0.05）。見表3。

3?討論

冠心病、高血壓、心竭等心腦血管疾病都和OSAHS存在一定的相關(guān)性[5]，而且動物模型和人體模型都證實了間歇缺氧和高血壓的相關(guān)性[2]。此次研究也證實了類似的結(jié)果，證明間歇缺氧確實能引起大鼠血壓升高（表1），一周的間歇缺氧就能有效引發(fā)大鼠血壓升高，兩周的間歇缺氧能形成穩(wěn)定的高血壓。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高血壓與血瘀關(guān)系較為密切，因氣虛而產(chǎn)生痰、瘀等，因此高血壓病可以從瘀辨證治療[6]。湯爾峰等利用抵當(dāng)湯的活血化瘀、瀉下通腑作用通過改善組織缺血缺氧而改善高血壓癥狀[7]。地龍降壓膠囊主要成分是地龍蛋白提取物，含有蚓激酶、纖溶酶、膠原酶、纖溶激活蛋白、微量元素等多種成分。它能通過影響人體凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)，減少了血管阻力、降低血液粘稠度而改善微循環(huán)，產(chǎn)生降壓作用[8]。此次研究發(fā)現(xiàn)，地龍降壓膠囊干預(yù)大鼠血壓明顯出現(xiàn)下降趨勢（表1），可能與地龍?zhí)崛∥锿ㄟ^改善微循環(huán)而改善組織缺氧有一定關(guān)系。

低氧誘導(dǎo)因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1） 是低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子， 由HIF-1α和HIF-1β組成， HIF-1α的表達(dá)受氧濃度的調(diào)節(jié)，對調(diào)節(jié)氧平衡非常重要，心肌缺血缺氧會引起HIF-1α 表達(dá)增加[9]。此次研究發(fā)現(xiàn)， 地龍降壓膠囊除了對間歇缺氧引起的大鼠高血壓有一定的改善作用外，而且經(jīng)過干預(yù)以后，大鼠心肌組織和心肌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)比間歇低氧組有明顯的降低（圖1、2）， 可能在一定程度上，地龍降壓膠囊促進(jìn)了微循環(huán)，因而改善了組織缺氧。另一方面，Harrington JP等發(fā)現(xiàn)地龍蛋白能夠被用作治療性氧載體[10]，可能本研究中地龍降壓膠囊在改善微循環(huán)的同時，也能增加組織供氧，因此對組織缺氧有一定的緩解和改善。而且生化酶學(xué)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧導(dǎo)致LDH活性升高，可能與無氧酵解加強有關(guān)，但地龍降壓膠囊干預(yù)后LDH明顯活性下降，然而SOD和GSH-PX活性與低氧模型組相比沒有顯著性差異（表3），可能進(jìn)一步證明地龍降壓膠囊是通過改善組織缺氧而不是抗氧化的方式來緩解缺氧性高血壓的癥狀。綜上所述，地龍降壓膠囊可能主要通過改善組織微循環(huán)而改善組織缺氧，因此對缺氧性高血壓的發(fā)生有一定緩解。

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（收稿日期：2019-06-24?編輯：程鵬飛）