簡曉依， 劉祥梅， 成丹，李苗芳，趙素萱

湖南師范大學(xué)體育學(xué)院， 湖南 長沙 410012

肝臟是人體內(nèi)最大的腺體和功能最復(fù)雜的器官之一，諸多研究表明其可因力竭運(yùn)動損傷.運(yùn)動對肝臟結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響的重要原因之一是肝線粒體的結(jié)構(gòu)和功能變化，適當(dāng)運(yùn)動有利于大鼠肝線粒體產(chǎn)生ATP，力竭運(yùn)動影響ATP合成[1～3].蛋白質(zhì)是人體結(jié)構(gòu)的重要組成部分和生命活動的直接執(zhí)行者，線粒體蛋白質(zhì)組的研究分析將提供洞察其功能變化有價值的信息，對探究運(yùn)動影響機(jī)體的過程和機(jī)制有重要作用.已有的研究證明，三周游泳訓(xùn)練與安靜控制組小鼠肝線粒體蛋白質(zhì)組差異表達(dá)明顯，特別是熱休克蛋白60(HSP60)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)和細(xì)胞色素b-c1復(fù)合體1(QCR1)表達(dá)上調(diào)，有保護(hù)線粒體和加強(qiáng)能量代謝電子傳遞過程的作用，這與適宜運(yùn)動益于肝臟關(guān)系密切[4].而基于蛋白質(zhì)組差異表達(dá)研究力竭運(yùn)動對訓(xùn)練機(jī)體肝線粒體影響的報導(dǎo)尚未查到，本研究采用2-DE電泳凝膠圖像分析三周訓(xùn)練及訓(xùn)練后力竭小鼠的肝線粒體蛋白質(zhì)差異表達(dá)，質(zhì)譜鑒定典型差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，試圖探討有訓(xùn)練機(jī)體力竭運(yùn)動后肝線粒體功能變化機(jī)制和為肝臟保健提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物與運(yùn)動方案

健康雄性ICR小鼠，體重30±2 g，購自湖南斯耐克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘) 2011-0003.以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水.室溫20±2 ℃，相對濕度40 %～55 %，每天光照12 h.小鼠靜養(yǎng)與觀察三日，按體重分層隨機(jī)分為訓(xùn)練組(TB)和訓(xùn)練力竭組(TA)，每組10只.

兩組小鼠放入深80 cm、直徑55 cm桶內(nèi)游泳，水溫28±2 ℃、水深40 cm，計時并注意觀察狀態(tài).第一周不負(fù)重30 min，第二周尾根部2 %負(fù)重40 min，第三周3 %負(fù)重40 min.每周五天，下午進(jìn)行，共進(jìn)行三周.訓(xùn)練結(jié)束休息2天，TA組小鼠尾根部負(fù)重3 %力竭游泳，記錄游泳至力竭時間.力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠沉入水中10 s，放在平面時呼吸深急，神情疲倦，垂頭俯臥，刺激后無反應(yīng)，無法完成翻正反射.

1.2 儀器設(shè)備和試劑

EPS 3500電源，IPGphor等電聚焦電泳系統(tǒng)購自Amersham公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳使用垂直平板電泳系統(tǒng)，購自bio-rad公司.其他儀器,如冷凍離心機(jī),722分光光度計,電動跑臺,脫色小搖床,真空自動吸引器均來自國產(chǎn).脲素，二硫蘇糖醇(DTT)，硫脲，NP-40，載體兩性電解質(zhì)(Parmalyte 3～10)，PMSF，CHAPS，Tris，SDS，碘乙酰胺，溴酚藍(lán)，丙烯酰胺，N.N′-亞甲雙丙烯酰胺，N′，N′，N′，N′-四甲基乙二胺(TMDEM)，過硫酸胺(AP)購自Bio-rad公司；硫代硫酸鈉來自Fluka公司；IPG buffer pH 3～pH 10和固相pH梯度等電聚焦干膠條(Immobiline dry strip pH 3～pH 10、長度18 cm)購自Pharmacia公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純.胞漿和線粒體蛋白提取試劑盒、非干擾型蛋白濃度定量試劑盒(SK3071)及質(zhì)譜檢測儀器與試劑由生工生物工程(上海)股份有限公司提供.

1.3 取材與樣品制備

TB組訓(xùn)練結(jié)束休息2天，TA組力竭游泳24 h后，稱取體重和麻醉，在冰上剖開腹腔，迅速取右肝前葉，放入預(yù)冷的冰生理鹽水中清洗，濾紙吸干水分，嚴(yán)格按照胞漿和線粒體蛋白提取試劑盒和非干擾型蛋白濃度定量試劑盒(SK3 071)的操作說明提取肝線粒體蛋白，組內(nèi)合并上清對蛋白定量，TB組蛋白濃度為30 μg/μL，TA組為29 μg/μL.各組提取液每管依蛋白質(zhì)濃度1 mg 分裝，保存在-80 ℃超低溫冰箱備用.

1.4 固相pH梯度-SDS雙向凝膠電泳及圖譜分析

一維電泳：每組樣品蛋白保證每個膠條有1 mg的蛋白質(zhì)分子的含量，分別加入水化液至350 μL [水化液為urea 12 g(終濃度8 mol·L-1)，CHAPS 0.5 g，IPG Buffer(pH 3.0～pH 10.0) 500 μL，1 %溴酚藍(lán)50 μL，加雙蒸水至25 mL]，把在室溫中平衡10 min的固相pH梯度干膠條放入加有上述樣品液的樣品槽.電壓時間積為4 189 Vh， 30 V低電壓水化13 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，最后穩(wěn)定在8 000 V 5 h等電聚焦，溫度設(shè)置為20 ℃.等電聚焦結(jié)束后進(jìn)行兩次各15 min的平衡.

二維電泳：平衡結(jié)束后膠條轉(zhuǎn)入二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，先進(jìn)行4.8 %的濃縮膠電泳，電壓為25 mA，時間約1 h，接著進(jìn)行10 %分離膠電泳,電壓為50 mA，時間約4 h.

電泳結(jié)束取下膠板，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，運(yùn)用清華紫光D3000圖像掃描儀掃描凝膠.每組各重復(fù)電泳三次，都選取第一張膠為參考膠進(jìn)行匹配.以TB組的蛋白質(zhì)2-DE代表圖譜作為參考膠,借助圖像分析軟件Bio-rad PDquest分析比較圖譜的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)差異.

1.5 MS(質(zhì)譜)鑒定

膠板平鋪于玻璃板，采用取點(diǎn)器將5倍以上差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，去離子水反復(fù)沖洗10 min，置于EP管中，移液槍吸盡水分.由生工生物工程(上海)股份有限公司酶解后MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜檢測.檢測結(jié)果通過Mascot查詢ncbi蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)，物種為小鼠.

2 結(jié)果

2.1 2-DE凝膠電泳掃描及圖譜分析結(jié)果

在相同條件下電泳分離TB和TA組小鼠肝線粒體蛋白，所得2-DE凝膠經(jīng)掃描和圖譜分析，檢測出蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)為TB組323±84個和TA組307±106個，匹配率分別為58±45 %和59±48 %.TA組和TB組差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)263個，2倍以上差異點(diǎn)80個，其中上調(diào)點(diǎn)48個，下調(diào)點(diǎn)32個.差異表達(dá)5倍以上蛋白點(diǎn)6個，上調(diào)和下調(diào)點(diǎn)各3個(圖1、表1).

2.2 MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果

5倍以上差異點(diǎn)獲成功鑒定的有5205號點(diǎn)、2113號點(diǎn)和7602號點(diǎn)，均為TA組比TB組下調(diào)的肝線粒體蛋白.5 205號點(diǎn)為烯酰輔酶A水合酶(Enoyl-CoA hydratase，ECHM)，其138號肽段氨基酸序列為其特定序列158～178(K.AQFGQPEILLGTIPGAGGTQR.L)，得分為139.2113號點(diǎn)為磷酸合成酶亞基δ(ATP synthase subunit delta，ATPD)，其55號肽段氨基酸序列為其特定序列137～150(K.AQSELSGAADEAAR.A)，得分為119.7 602號點(diǎn)為甲基丙二酸半醛脫氫酶(Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase[acylating]，MMSA)，其102號肽段氨基酸序列為其特定序列256～272(K.AISFVGSNQAGEYIFER.G)，得分為149(圖2、表2).

TB組TA組圓圈:上調(diào) 方塊:下調(diào)

圖1 TA和TB組凝膠掃描圖譜及5倍差異表達(dá)蛋白點(diǎn)位置Fig.1 The Gel scanning Image of two groups and the location of 5 folds protein points

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圖2 鑒定蛋白的特定氨基酸序列圖Fig.2 The specific amino acid sequence diagrams of the identification protein

3 分析與討論

目前，有關(guān)衰老、某些病理狀況和治療處理因素導(dǎo)致的肝線粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)變化有研究報道[5～8]，促進(jìn)了我們對生理病理和影響因素作用下肝臟結(jié)構(gòu)和功能變化機(jī)制的深入理解.我們的研究證明，適宜運(yùn)動有益于肝臟，與肝線粒體蛋白質(zhì)組HSP60、ALDH2和QCR1顯著上調(diào)關(guān)系密切[4].而本實驗的訓(xùn)練小鼠進(jìn)行力竭運(yùn)動后24 h，肝線粒體差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)263個，2倍以上差異點(diǎn)80個，5倍以上差異點(diǎn)6個，將影響機(jī)體肝線粒體功能.本實驗質(zhì)譜成功鑒定出了下調(diào)5倍以上的三個蛋白，它們?yōu)榫€粒體物質(zhì)能量代謝相關(guān)的重要酶或亞基ECHM、ATPD、MMSA，對其表達(dá)變化分析能為力竭機(jī)體肝線粒體功能變化和肝臟保健提供理論依據(jù).

5205號是烯酰輔酶A水合酶(Enoyl-CoA hydratase，ECHM/ECHS1/ECHA)，也稱脂酰輔酶A水合酶,為生物體內(nèi)普遍存在和位于線粒體基質(zhì)的脂肪酸β-氧化途徑中的重要酶[9].線粒體中脂肪酸的氧化是能量提供的重要途徑，尤其葡萄糖代謝水平下降的時候.而脂肪酸β-氧化是脂肪酸分解的主要途徑，能很有效地供應(yīng)機(jī)體所需的大量能量，其過程涉及多種相關(guān)酶，經(jīng)重復(fù)脫氫、水合、再脫氫、硫解基本反應(yīng)循環(huán).ECHS1每個蛋白含有261個氨基酸亞基,是催化β氧化的關(guān)鍵酶和第二個限速步驟,對體內(nèi)能量提供重要作用[10].它使反式烯脂酰輔酶A的雙鏈上加上一分子水形成L(+)β-羥脂酰輔酶A，并催化3-順-烯酰-CoA轉(zhuǎn)化成3-反-烯酰-CoA或2-反-烯酰-CoA,使核黃素腺鏢呤核苷酸(FAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2),然后進(jìn)入脂肪酸-β氧化.ECHS1在機(jī)體脂質(zhì)代謝中發(fā)揮的作用非常重要,功能障礙會抑制線粒體中脂肪酸β氧化，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)沉積[11～13].NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積為特征的疾病，發(fā)生的關(guān)鍵取決于脂質(zhì)氧化、分解代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)是否處于動態(tài)平衡，一旦這個平衡被打破可造成脂代謝紊亂.有研究證實,SHBs轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞靶向下調(diào)ECHS1可在核酸水平使ACC、CPT1A表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶水平、細(xì)胞內(nèi)膽固醇及甘油三酯含量均上調(diào)，關(guān)系到肝臟中脂質(zhì)的蓄積[14].肝臟中脂肪堆積容易形成脂肪肝，有學(xué)者運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)NAFLD大鼠模型和患者的肝組織中ECHS1表達(dá)水平顯著下降[15].鐘小蘭等發(fā)現(xiàn)束縛所致肝郁證的動物肝組織ECHM表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為機(jī)體代謝降低及肝細(xì)胞去分化的加強(qiáng)影響了該酶的誘導(dǎo)和對氧的消耗[16].有氧耐力訓(xùn)練能提高機(jī)體有氧代謝供給能力，袁愛國報道4周、8周和12周中等強(qiáng)度運(yùn)動負(fù)荷訓(xùn)練的大鼠左心室肌ECHM均出現(xiàn)上調(diào)[17].理論上肝線粒體ECHM也應(yīng)因運(yùn)動訓(xùn)練上調(diào)，但相關(guān)研究報道尚未查到.本研究的訓(xùn)練小鼠一次力竭后24 h，肝線粒體ECHM的表達(dá)比單純訓(xùn)練小鼠顯著下調(diào)18.74倍.我們認(rèn)為力竭消耗大量能源，使葡萄糖耗竭和糖代謝供能水平下降，機(jī)體脂肪酸β氧化供能成為主要途徑，同時蛋白質(zhì)的分解過程增強(qiáng)，脂肪酸β氧化過程的重要酶因而消耗、破壞增多和再合成減少導(dǎo)致了這一結(jié)果.提示有訓(xùn)練機(jī)體因力竭運(yùn)動可使肝內(nèi)脂肪酸β氧化障礙，而容易出現(xiàn)肝臟脂代謝異常，若膳食營養(yǎng)不合理尤其含脂量高，可能使肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積產(chǎn)生脂肪肝病.因此，運(yùn)動員應(yīng)在劇烈運(yùn)動比賽和體力過度消耗后特別注意膳食低脂.

2113號是磷酸合成酶亞基δ(ATP synthase subunit delta，ATPD).線粒體內(nèi)膜有復(fù)合酶NADH還原酶、琥珀酸氧化還原酶、細(xì)胞色素C氧化還原酶、細(xì)胞色素C氧化酶和ATP合成酶，稱為復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V.線粒體內(nèi)膜上進(jìn)行的氧化磷酸化和能量轉(zhuǎn)化等通過呼吸鏈酶NADH呼吸鏈(主要有復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ)和FADH2呼吸鏈(主要有復(fù)合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，最終在ATP合成酶作用下細(xì)胞內(nèi)熱能代謝產(chǎn)物氧化生成水和能量，這一過程中任何復(fù)合酶質(zhì)量改變都可能引起線粒體功能障礙.ATP合成酶是線粒體內(nèi)膜突出于基質(zhì)中的水溶性蛋白，參與ADP磷酸化與ATP合成，是合成ATP的關(guān)鍵蛋白.合成ATP的酶主要是F1F0型，由2個亞單位水溶性的F1和鑲嵌在內(nèi)膜上的脂溶性疏水蛋白復(fù)合體F0構(gòu)成[18，19].F1部分由3α、3β、1γ、1δ和1ε共9個亞基組成，F(xiàn)0部分由a、b和c亞基組成.不同來源的ATP合成酶基本上有相同的多亞基組成和結(jié)構(gòu)，F(xiàn)1的α和β亞基上均有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，其中β亞基的結(jié)合位點(diǎn)具有催化ATP合成或水解活性，為ATP合成酶功能催化亞基.F1中3個α和3個β亞基交替排列成“瓣狀”圓球體結(jié)構(gòu)，γ亞基與ε亞基結(jié)合在一起形成“轉(zhuǎn)子”，位于α3和β3的中央，共同旋轉(zhuǎn)以調(diào)節(jié)三個β亞基催化位點(diǎn)開放和關(guān)閉.Fo多拷貝的c亞基形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，a和b二聚體排列在c亞基環(huán)狀外側(cè)，a、b、δ亞基共同組成“定子”.在合成ATP的過程中，“轉(zhuǎn)子”通過Fo形成一個跨膜質(zhì)子通道，在氫離子流的推動下旋轉(zhuǎn)，依次與三個β亞基作用，調(diào)節(jié)β亞基催化位點(diǎn)構(gòu)象，“定子”在一側(cè)將α3、β3與Fo連接，將跨膜質(zhì)子動力勢能轉(zhuǎn)換成力矩，推動“轉(zhuǎn)子”旋轉(zhuǎn)，ADP與磷酸基團(tuán)被催化結(jié)合成ATP[20].Rose等發(fā)現(xiàn)健康男青年單腿耐力訓(xùn)練后腿部肌肉線粒體F(1)-ATP合酶表達(dá)增加約兩成，周錦琳等發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度負(fù)荷運(yùn)動后股四頭肌H+-ATP酶活性增加約36 %[21，22].袁愛國報道，中等強(qiáng)度運(yùn)動后大鼠左心室肌的ATP合酶α亞基表達(dá)顯著上調(diào)，可提高心肌能量代謝水平[23].ATPD是磷酸合成酶F1部分的δ亞基，關(guān)系“定子”組成，運(yùn)動對ATPD影響的研究報道尚未查到.本研究發(fā)現(xiàn)力竭使訓(xùn)練小鼠肝線粒體的ATPD表達(dá)量下調(diào)9.03倍，可能δ亞基嚴(yán)重不足，“定子”結(jié)構(gòu)將形成減少和不穩(wěn)定，將使α3、β3與Fo連接受限，跨膜質(zhì)子動力勢能轉(zhuǎn)換成力矩推動“轉(zhuǎn)子”旋轉(zhuǎn)將受影響，ADP與磷酸基團(tuán)被催化結(jié)合成ATP的效率降低，這可能是肝線粒體ATP生成減少和功能受影響的重要機(jī)制，并可能是力竭機(jī)體處于疲勞或功能性障礙狀態(tài)的原因.

7602號是線粒體甲基丙二酸半醛脫氫酶【?；?Methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase, MMSDH/ALDH6A1),分子量58.396 KDa，等電點(diǎn)8.44，為由535個氨基酸殘基構(gòu)成的四聚體酶蛋白.其位于線粒體基質(zhì)空間，在肝臟、腎臟和心臟中高表達(dá)，在肌肉和腦組織中低表達(dá)，屬于乙醛脫氫酶超家族，是唯一需要輔酶A的一類醛脫氫酶(ALDH)-ALDH6A1[24].MMSDH參與纈氨酸和胸腺嘧啶分解代謝分解：纈氨酸代謝產(chǎn)生(S)-3-羥基酸(HIBA),由3-羥基異丁酸脫氫酶氧化成(S)-甲基丙二酸半醛(methylmalonate semialdehyde，MMSA)；胸腺嘧啶代謝生成(R)-氨基異丁酸(AIBA)，然后脫氨基成(R)-甲基丙二酸半醛.MMSA的S和R兩種異構(gòu)體經(jīng)MMSDH催化不可逆氧化脫羧，以丙二酸半醛(malonate semialdehyde，MSA)再不可逆氧化脫羧，分別成為乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和丙酰輔酶A(propionyl-CoA，PPCoA)，這些反應(yīng)處于纈氨酸和嘧啶代謝途徑的末端，是纈氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一[25～27].ALDH6A1通過代謝丙二酸半醛轉(zhuǎn)變成乙酰輔酶A，包括脂質(zhì)過氧化醛如丙二醛[24].檸檬酸循環(huán)是糖進(jìn)行有氧氧化第三階段的重要環(huán)節(jié)，影響氧化磷酸化的徹底氧化.MMSDH作為纈氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，催化MMSA氧化脫羧形成的PPCoA在檸檬酸循環(huán)中轉(zhuǎn)變成琥珀酰輔酶(succinyl CoA)，琥珀酰輔酶作為磷酸化底物徹底分解產(chǎn)生琥珀酸和ATP.甲狀腺切除的腎陽虛模型大鼠的肝線粒體蛋白質(zhì)組與正常大鼠間具有差異，其中MMSDH屬于顯著表達(dá)上升蛋白，研究者認(rèn)為是糖脂代謝障礙促使蛋白質(zhì)氨基酸分解代謝加速的反映[28].運(yùn)動機(jī)體MMSDH的研究報道有4周有氧運(yùn)動后大鼠心房肌的表達(dá)上調(diào)6.3倍，說明4周有氧運(yùn)動可能通過其表達(dá)加強(qiáng)心肌細(xì)胞線粒體的三羧酸循環(huán)，促進(jìn)ATP的生成，改善心肌細(xì)胞能量需求以提高心肌抗氧化損傷的能力，從而發(fā)揮心肌延遲保護(hù)作用[29].本研究顯示，力竭運(yùn)動使訓(xùn)練小鼠肝線粒體MMSDH表達(dá)下調(diào)7.75倍，依據(jù)以上其與蛋白質(zhì)氨基酸、丙二醛、檸檬酸代謝的關(guān)系分析可知：(1)力竭使訓(xùn)練小鼠能源耗竭，并且肝線粒體內(nèi)纈氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶減少，蛋白質(zhì)氨基酸分解代謝供能難以為繼；(2)力竭使MMSA氧化脫羧形成的PPCoA減少，勢必使肝線粒體檸檬酸循環(huán)速率降低，糖有氧氧化第三階段障礙；(3)力竭運(yùn)動產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化醛如丙二醛，其轉(zhuǎn)化消除形成障礙將導(dǎo)致其在體內(nèi)堆積.因此，雖然適當(dāng)運(yùn)動利于肝線粒體ATP產(chǎn)生和減少脂質(zhì)過氧化物的堆積，但力竭運(yùn)動將使訓(xùn)練機(jī)體能源耗竭、肝線粒體涉及到蛋白質(zhì)氨基酸的能量代謝酶的質(zhì)與量改變和脂質(zhì)過氧化損害增加，最終極度疲勞，這是力竭疲勞的重要機(jī)制之一.

4 結(jié)論

力竭將使訓(xùn)練小鼠的肝線粒體蛋白質(zhì)組發(fā)生差異表達(dá)，能量代謝酶烯酰輔酶A水合酶、甲基丙二酸半醛脫氫酶和磷酸合成酶亞基表達(dá)明顯下調(diào).這三種酶或亞基的表達(dá)下調(diào)關(guān)系到肝臟線粒體糖、脂、蛋白代謝障礙和影響ATP生成，并可能伴隨脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛及脂質(zhì)在肝內(nèi)堆積，這是力竭運(yùn)動損害機(jī)體肝和肝線粒體功能，促使機(jī)體力竭疲勞的重要機(jī)制，并有可能增加罹患脂肪型肝病風(fēng)險.