崔欣萍，馮佳卉，趙春穎，趙 晴，趙 碩，劉金欣、2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所）

金蓮花(Trollius chinensisBge.)是毛茛科金蓮花亞科多年生草本植物的干燥花及花蕾[1]。金蓮花味微苦、性寒、無(wú)毒，具有清熱解毒、滋補(bǔ)陰氣、清熱降火、抗菌消炎、養(yǎng)陰清熱、消炎殺菌等功效[2]。金蓮花以花入藥，其形態(tài)受氣候環(huán)境等多種因素影響，采用傳統(tǒng)鑒定方法具有一定局限性。DNA條形碼技術(shù)是基于遺傳物質(zhì)DNA對(duì)物種進(jìn)行鑒定，不受生長(zhǎng)環(huán)境、地理位置及人為因素的影響。本研究嘗試建立一種基于ITS2序列的DNA條形碼鑒定方法，以期為中藥材金蓮花的鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究共收集11份來(lái)自河北、山西、東北等地的金蓮花樣品，產(chǎn)地信息見(jiàn)附表：

附表 金蓮花樣品產(chǎn)地信息

1.2 金蓮花DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 每份樣品取一朵干凈無(wú)霉斑的完整花朵進(jìn)行取樣，每份取樣30mg，利用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取總DNA。PCR擴(kuò)增使用植物DNA條形碼ITS2序列通用引物和程序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行雙向序列測(cè)定。依據(jù)《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》對(duì)測(cè)序峰圖質(zhì)量進(jìn)行判斷。

1.3 數(shù)據(jù)分析 利用CodonCode Aligner V7.0.1軟件去除測(cè)序結(jié)果的低質(zhì)量部分，并進(jìn)行峰圖的校對(duì)拼接，獲得ITS2間隔區(qū)序列；基于隱馬爾可夫模型[3](hidden Markov model )對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Hmmer V3.1軟件去除5.8S區(qū)段和28S區(qū)段獲得ITS2序列；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行物種鑒定。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花樣品DNA提取結(jié)果 為考察DNA提取方法的穩(wěn)定性，對(duì)編號(hào)為JLH07和JLH09的樣品做了三次重復(fù)試驗(yàn)，共提取了15份樣品的DNA。采用NanoDrop2000c型超微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度，DNA濃度平均值為186.59ng/μl，A260/A280值在1.93～2.10之間，A260/A230值在0.85～1.44之間。所有金蓮花樣品均成功提取DNA，且獲得的DNA純度較高。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)電泳及凝膠成像檢測(cè)PCR產(chǎn)物，所有樣品均可檢測(cè)到明亮、清晰的條帶，產(chǎn)物大小為480bp。電泳及凝膠圖譜見(jiàn)圖1：

圖1 金蓮花樣品的電泳及凝膠圖譜

2.3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 通過(guò)MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)（見(jiàn)圖2）。將金蓮花和淡紫金蓮花的標(biāo)準(zhǔn)序列加入到NJ樹(shù)中后，發(fā)現(xiàn)所有樣品共分為兩支，其中樣品編號(hào)JLH05和JLHZ08單獨(dú)聚為一支，與淡紫金蓮花序列一致，其余序列與金蓮花的序列一致。說(shuō)明，基于ITS2的DNA條形碼可以準(zhǔn)確鑒定金蓮花與淡紫金蓮花。

圖2 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

中藥品種繁多且混雜，加之大多以根莖葉花等部位局部入藥，沒(méi)有完整的植物形態(tài)，故依靠傳統(tǒng)的鑒定方法對(duì)藥材進(jìn)行鑒定有一定的局限性。2010年，陳士林等[4]提出將ITS2作為藥用植物通用條形碼，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其能對(duì)物種進(jìn)行快速有效地鑒別?，F(xiàn)如今，基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)已在蕓香科[5]、傘形科[6]等多種科屬的藥用植物物種鑒定方面得到廣泛應(yīng)用。徐曉蘭等[7]進(jìn)行了山豆根基原植物及其混偽品的鑒定，結(jié)果表明ITS2序列可以很好地鑒定山豆根基原植物；石林春等[8]進(jìn)行了天南星及其混偽品的鑒定，結(jié)果表明ITS2序列可以有效地鑒定天南星3種基原及其混偽品。上述研究結(jié)果均提示，ITS2序列在中藥材鑒定方面有一定的優(yōu)越性，為中藥材的鑒定及用藥安全等提供了有力支持。

本研究收集了11份金蓮花樣品，采用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定研究，分析獲得的ITS2序列和NJ樹(shù)，發(fā)現(xiàn)有9份樣品為金蓮花，2份樣品為淡紫金蓮花。本研究證明，基于ITS2的DNA條形碼技術(shù)可以準(zhǔn)確有效地鑒別金蓮花，可為中藥材金蓮花的鑒定提供參考依據(jù)。