王 新，湯江武，吳逸飛，姚曉紅，孫 宏，沈 琦，李園成

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

在現(xiàn)有的水體修復(fù)技術(shù)中，生物修復(fù)具有環(huán)境友好、生態(tài)節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)，是一種備受重視、迅速發(fā)展的水環(huán)境治理技術(shù)。其中，微生物在污染物的轉(zhuǎn)化和去除過(guò)程中起著核心作用。近年來(lái)，基于微生物的污染水體修復(fù)技術(shù)作為一種公認(rèn)的高效、低成本的生物修復(fù)技術(shù)手段，得到了廣泛的認(rèn)可和成功的應(yīng)用[1-3]。向污染水體中直接投加功能微生物或能促進(jìn)原位功能微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是當(dāng)前微生物原位修復(fù)過(guò)程中通用的方法。已有的研究中，用于水體生物修復(fù)的菌劑多為單一菌，一些復(fù)合凈水功能菌劑也多為不同菌種的簡(jiǎn)單組合、復(fù)配，難以適應(yīng)復(fù)雜多變的污染水環(huán)境，在水體中的定殖能力和生態(tài)活性低，且面臨在原位流動(dòng)水體中容易散失等問(wèn)題[4-6]，不適用于原位水體強(qiáng)化修復(fù)。解決該問(wèn)題的核心在于持續(xù)穩(wěn)定地增加適用于水體污染降解和轉(zhuǎn)化的、執(zhí)行不同功能的微生物，以強(qiáng)化水體原位生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化循環(huán)過(guò)程。因而，開(kāi)發(fā)易定殖、高活性的復(fù)合凈水功能菌劑，是當(dāng)前該領(lǐng)域的重要基礎(chǔ)性問(wèn)題[7-8]。關(guān)于復(fù)合菌劑的構(gòu)建，現(xiàn)有研究通常采用平板劃線法檢測(cè)菌株之間是否存在拮抗，然后以此為基礎(chǔ)進(jìn)行復(fù)配和性能檢驗(yàn)[9-10]。此類方法的局限之處在于，復(fù)合菌劑的構(gòu)建效率較低，且難以反映不同細(xì)菌在共同生長(zhǎng)條件下的競(jìng)爭(zhēng)狀況，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用效果不穩(wěn)定。

從前期研究獲得的凈水功能菌出發(fā)，以混合培養(yǎng)后的菌群動(dòng)態(tài)變化為依據(jù)，探索分子監(jiān)測(cè)條件下的復(fù)合菌群構(gòu)建方法，旨在為復(fù)合凈水功能菌群的構(gòu)建和高效應(yīng)用，以及污染水體微生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)的深化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

用于構(gòu)建凈水復(fù)合功能菌群的菌株系前期從環(huán)境中分離獲得的，分別具有氨氧化、反硝化、化學(xué)需氧量(COD)降解等功能，具體編號(hào)和相關(guān)信息詳見(jiàn)表1。菌株活化、準(zhǔn)備均采用LB培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)平板劃線法培養(yǎng)檢測(cè)，這些菌株兩兩之間均不存在拮抗作用。

1.2 不同凈水功能菌株的混合培養(yǎng)特性

用LB液體培養(yǎng)基對(duì)11株菌株進(jìn)行培養(yǎng)，每2 h取樣一次，測(cè)定D600，確定各菌株的生長(zhǎng)曲線。將處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的各菌株培養(yǎng)物，參照D600值最小的菌株培養(yǎng)物的D600值，用新鮮的LB培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，然后各取0.1 mL菌液進(jìn)行混合，作為起始混合菌液。分別取20、50 μL接入各2個(gè)裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、160 r·min-1的條件下進(jìn)行混合培養(yǎng)，分別在12、24、48 h取樣。對(duì)樣品提取基因組DNA并進(jìn)行PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，確定所有菌株在共培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性。

1.3 不同凈水功能菌株組合的混合培養(yǎng)特性

通過(guò)1.2節(jié)實(shí)驗(yàn)，初步確定菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)在所有菌株混合共培養(yǎng)條件下可以良好生長(zhǎng)。以這4株菌為主體，分別與其他菌株進(jìn)行組合(表2)?？紤]到菌株S2(ADH1)和S4(GC5)具有反硝化功能，在組合中作為重要待測(cè)菌株。參照1.2節(jié)方法，每菌株懸液加入0.1 mL，混合菌液的接種量統(tǒng)一為10 μL，進(jìn)行混合培養(yǎng)，在0和24 h取樣，分析菌群結(jié)構(gòu)，篩選適合的復(fù)合菌群組合。

表1 用于構(gòu)建復(fù)合功能菌群的凈水功能菌株

Table1Water purifying functional strains used for compound bacteria construction

編號(hào)No.菌株Strain菌株種類Species功能FunctionS1AOZ1Pseudomonas putida氨氧化AmmoxidationS2ADH1Pseudomonas stutzeri反硝化DenitrificationS3W14Bacillus cereus氨氧化AmmoxidationS4GC5Pseudomonsa sp.反硝化DenitrificationS5BJ-1Bacillus subtilisCOD降解 COD degradationS6BSK9Bacillus pumilusCOD降解 COD degradationS7BSK3Bacillus polymyxa抑菌除臭Antibacteria and deodorizationS8ZZC-3Rhodospirillum sp.氨氧化AmmoxidationS9ZZC-4Achromobacter denitrificans反硝化DenitrificationS10ZZC-14Rhodospirillum sp.氨氧化AmmoxidationS11ZH-1Rhodospirillum centenum氨氧化Ammoxidation

表2 凈水功能菌組合

Table2Settings of compounder water purifying functional bacteria

編號(hào)No.菌株組成StrainsG1S1, S11G2S1, S3, S6, S7G3S1, S2, S3, S4, S5, S8, S9, S10, S11G4S1, S2, S4, S5, S6, S8, S9, S10, S11G5S2, S3, S4, S5, S7, S8, S9, S10, S11G6S1, S2, S3, S4, S5, S6G7S1, S2, S3, S4, S6, S7G8S1, S2, S3, S6, S9G9S1, S6, S8, S9

1.4 復(fù)合凈水菌劑凈水效果實(shí)驗(yàn)

根據(jù)凈水功能菌群組合的篩選結(jié)果，確定以S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)等4株菌為核心，復(fù)配復(fù)合菌劑，經(jīng)培養(yǎng)后用于河道水體的凈水效果實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組及處理方式如表3所示。實(shí)驗(yàn)用河道水樣采自杭州市城郊某河道，水體氨氮(NN)含量為4.5 mg·L-1，COD為32 mg·L-1。采集的水樣分裝1 L于4 L的三角瓶中，每個(gè)菌劑組合設(shè)置一個(gè)平行樣。將培養(yǎng)后的菌株離心沉淀，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌蒸餾水重懸，所有菌株經(jīng)無(wú)菌水稀釋至相同D600值后備用。按照0.5%體積分?jǐn)?shù)加入菌液，單菌直接加入，混菌中各單菌的比例相同。加入5 mL復(fù)合菌劑或單菌后，在搖床中以120 r·min-1、30 ℃的條件培養(yǎng)，分別在0、1、2、3、4 d取樣，分析水樣中COD、氨氮、總氮(TN)的變化，其中，0 d為加入菌懸液后取得的樣品。

表3 復(fù)合凈水菌劑凈水效果實(shí)驗(yàn)菌株組成

Table3Strains used in the water purification test

編號(hào)No.菌株組成StrainsT1S1T2S3T3S6T4S7T5S2, S4T6S1, S2, S4T7S2, S4, S6T8S2, S3, S4T9S2, S4, S7T10S1, S3, S6, S7T11S1, S2, S4, S6T12S2, S3, S4, S7

1.5 混合培養(yǎng)液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析

1.5.1 DNA提取

各菌株由斜面中接出，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取1 mL菌液離心，收集菌泥。取混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物0.5 mL，離心，收集菌泥。采用Bioready bacterial gnomic DNA extraction kit提取樣品中的基因組DNA，獲得的DNA經(jīng)電泳檢測(cè)后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR-DGGE分析

以提取的樣品基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)片段，引物為連有“GC-夾子”(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3′)的Eubac341f(5′-TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和Eubac517r(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)[11-12]，參考文獻(xiàn)[13-14]中描述的方法，采用Touchdown PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用Bio-Rad公司D-code System進(jìn)行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性梯度40%～60%。在60 ℃、50 V條件下電泳1.5 h，然后升電壓至150 V，繼續(xù)電泳6 h。聚丙烯酰胺凝膠在EB染液中染色25 min，用TANNON-2500凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6 分析方法與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

水樣中COD含量采用重鉻酸鉀比色法測(cè)定，TN含量采用耶拿MULTIN/C 3100型總有機(jī)碳/總氮分析儀測(cè)定，NN含量參照HJ 536—2009中的方法測(cè)定。各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)在測(cè)定時(shí)均采用3個(gè)平行樣品。

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)有顯著差異的處理，采用Tukey法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈水菌株及其共同混合培養(yǎng)物的DGGE分析

提取11株凈水菌株及所有菌株混合培養(yǎng)物的基因組DNA，并擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。如圖1所示，1～11號(hào)泳道分別為單菌S1～S11，12號(hào)泳道為所有菌株的初始混合物，13～14、15～16、17～18號(hào)泳道分別為菌株混合培養(yǎng)12、24、48 h的結(jié)果。圖1中共顯示6條條帶，其中，菌株S1(AOZ1)和S6(BSK9)、S2(ADH1)和S4(GC5)、S3(W14)和S7(BSK3)，以及S8(ZZC-3)、S10(ZZC-14)和S11(AH-1)所示條帶均處于相同的位置。但前期實(shí)驗(yàn)表明，這些菌株的菌落形態(tài)和16S rDNA基因有明顯的差異。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與細(xì)菌16S rDNA基因存在多拷貝，以及DGGE技術(shù)本身存在的一些不足有關(guān)。所有菌株的混合物在培養(yǎng)24 h和48 h后的DGGE圖譜中僅顯示2個(gè)主要條帶，對(duì)照DGGE圖譜中各個(gè)菌株的位置，可以初步確定，菌株S1(AOZ1)或S6(BSK9)、S3(W14)或S7(BSK3)在所有菌株共同培養(yǎng)時(shí)，單獨(dú)或共同成為優(yōu)勢(shì)菌。

2.2 不同凈水功能菌株初篩組合培養(yǎng)物的DGGE分析

以菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)為主體進(jìn)行復(fù)合菌群的初篩，DGGE圖譜如圖2所示，其中，1～9號(hào)泳道對(duì)應(yīng)表2的G1～G9(0 h)，10～18號(hào)泳道對(duì)應(yīng)表2的G1～G9(24 h)，M為所有菌16S rDNA基因片段的混合物。初始混合物中所有菌株均在相應(yīng)的泳道出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的條帶，培養(yǎng)24 h后，混合培養(yǎng)物組成里包含有S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)和S7(BSK3)4株菌的組合，且其均在相應(yīng)的培養(yǎng)物中成為優(yōu)勢(shì)菌。該結(jié)果充分表明，這幾株菌在混合培養(yǎng)過(guò)程中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。除菌株S2(ADH1)和S4(GC5)在一些培養(yǎng)物中仍能生長(zhǎng)外，其他菌株的生長(zhǎng)均受到明顯的抑制。相對(duì)于菌株S1(AOZ1)和S6(BSK9)，S3(W14)和S7(BSK3)同時(shí)存在對(duì)菌株S2(ADH1)和S4(GC5)的生長(zhǎng)抑制能力更強(qiáng)，如圖2泳道5(0 h)和14(24 h)所示。

泳道1～11，菌株S1～S11；泳道12，各菌株初始混合物；泳道13～14，培養(yǎng)12 h的各菌株混合物；泳道15～16，培養(yǎng)24 h的各菌株混合物；泳道17～18，培養(yǎng)48 h的各菌株混合物。Lane 1-11， Strain S1-S11， respectively; Lane 12， Initial compound bacteria; Lane 13-14， compound bacteria after 12 h; Lane 15-16， compound bacteria after 24 h; Lane 17-18， compound bacteria after 48 h.圖1 各凈水功能菌株及其混合培養(yǎng)物的DGGE圖譜Fig.1 DGGE profiles of 16S rDNA gene V3 fragments of different water purifying functional strains and their mixture

泳道1～9的菌株對(duì)應(yīng)表2中的G1～G9 (0 h)，泳道10～18的菌株對(duì)應(yīng)表2中的G1～G9 (24 h)，泳道M為所有基因片段的混合物。Lane 1-9， G1-G9 in Table 2 at 0 h， respectively; Lane 10-18， G1-G9 in Table 2 at 24 h， respectively; Lane M， All the gene fragments in all test strains.圖2 不同凈水功能菌株初篩組合培養(yǎng)物的DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of 16S rDNA gene V3 fragments of compound bacteria in preliminary screening test

圖3 復(fù)合凈水菌劑作用下水體COD、NN、TN的變化Fig.3 Variation of COD， NN and TN under compound bacteria in 4 d

2.3 復(fù)合凈水菌劑的凈水效果

對(duì)菌株S1(AOZ1)、S3(W14)、S6(BSK9)、S7(BSK3)，以及以其為主體構(gòu)建的復(fù)合菌劑，用河道原位水進(jìn)行凈水效果實(shí)驗(yàn)。結(jié)果(圖3)顯示，4 d之內(nèi)，相對(duì)于不加菌的對(duì)照(CK)，COD的最高去除率為T10組合的48.0%，其中，含有菌株S6的組合，COD去除率均超過(guò)40.2%，顯著(P<0.05)高于其他菌株組合。NN的最高去除率同樣為組合T10(76.8%)，含有菌株S1的組合，氨氮去除率均超過(guò)69.2%，顯著(P<0.05)高于其他菌株組。在4 d內(nèi)，TN的最高去除率為組合T11，約為42.8%，其他含有菌株S2和S4的組合之間總氮的去除率差異不顯著，但顯著(P<0.05)高于未含有S2和S4的組合。對(duì)COD和NN均有較高去除率的T10的TN去除率僅為23.9%。菌株S1和S6分別具有NN降解和COD降解的功能，在組合的情況下，對(duì)污染水體中的COD和NN均具有較好的去除效果。實(shí)驗(yàn)所用的河道水體本身含有大量的微生物，這說(shuō)明以菌株S1和S6為主體構(gòu)建的復(fù)合菌劑可以有效在水體中定殖、生長(zhǎng)，并實(shí)現(xiàn)凈水功能。

3 討論

水體污染物的降解和轉(zhuǎn)化主要依賴于微生物的作用[15]，這也是人類利用功能微生物修復(fù)污染環(huán)境的基礎(chǔ)。通過(guò)強(qiáng)化水環(huán)境中的功能微生物，進(jìn)而加快污染降解、轉(zhuǎn)化進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)水體污染物去除和生態(tài)修復(fù)，是當(dāng)前的思路。在實(shí)踐中，無(wú)論是直接投加功能微生物，還是調(diào)控水體生態(tài)環(huán)境，使原位環(huán)境中的土著功能微生物增殖、強(qiáng)化，其本質(zhì)都是提高特定種類的微生物生態(tài)功能，以實(shí)現(xiàn)其生態(tài)效應(yīng)。顯然，投加的微生物能否在原位環(huán)境下定殖和生長(zhǎng)，是影響微生物強(qiáng)化修復(fù)效果的核心問(wèn)題?，F(xiàn)有的水體微生物強(qiáng)化修復(fù)實(shí)踐中，光合細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌等菌劑得到了較多的應(yīng)用，盡管已經(jīng)取得了一定的效果，但也存在投加微生物作用不明確、應(yīng)用效果不穩(wěn)定等問(wèn)題[5-8]，這與污染水環(huán)境的水質(zhì)和水體生態(tài)的復(fù)雜性有關(guān)。因此，組合適應(yīng)能力更強(qiáng)、功能范圍更廣的復(fù)合菌，是今后一段時(shí)間內(nèi)的重要基礎(chǔ)性工作之一，這也是本研究的出發(fā)點(diǎn)。

菌株之間的組合并不是簡(jiǎn)單的復(fù)配，還要面臨生長(zhǎng)相容、功能耦合、定殖迅速、活性高等一系列考驗(yàn)。傳統(tǒng)的復(fù)合菌群構(gòu)建，基本上是先對(duì)不同菌分別組合，然后通過(guò)功能效果進(jìn)行檢驗(yàn)和篩選[9，16-18]，或者直接通過(guò)長(zhǎng)期的馴化，直接獲得復(fù)合菌群[9，19]。這種模式不但效率較低，而且實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成的菌群在原位環(huán)境中應(yīng)用時(shí)也會(huì)出現(xiàn)功能不穩(wěn)定的問(wèn)題。針對(duì)水環(huán)境而言，功能菌株在其中的定殖和生態(tài)功能的實(shí)現(xiàn)，實(shí)質(zhì)上是一個(gè)在原位環(huán)境中生長(zhǎng)和增殖的過(guò)程。因此，在復(fù)合菌群的構(gòu)建過(guò)程中，確保菌株的生長(zhǎng)是一個(gè)極其重要的問(wèn)題?，F(xiàn)有的分子生態(tài)技術(shù)的發(fā)展[20-21]，可以有效監(jiān)測(cè)混合培養(yǎng)過(guò)程中菌株增殖和菌群的變化情況，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相結(jié)合，可以有效發(fā)掘能夠復(fù)配的出發(fā)菌株，并通過(guò)菌株功能的互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)不同功能復(fù)合凈水功能菌群的構(gòu)建。盡管采用這種模式獲得的復(fù)合菌群，如以往獲得的大多數(shù)復(fù)合菌群一樣，可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室混合培養(yǎng)和原位環(huán)境的差異而在實(shí)際應(yīng)用中達(dá)不到預(yù)期的功能效果，但在菌群構(gòu)建這一過(guò)程中具有明顯的優(yōu)勢(shì)?；谶@種理念，本研究快速、有效地初步從11株功能菌中篩選出在混合培養(yǎng)條件下能生長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌的菌株AOZ1、W14、BSK9和BSK3，并通過(guò)進(jìn)一步的凈水實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建出適合水體污染物去除的復(fù)合凈水功能菌群，且在模擬凈水實(shí)驗(yàn)中，菌群表現(xiàn)出對(duì)河道污水中COD和NN較高的去除率。