董 雪,徐雨昕,郭 晶,龔忠闊,夏霖亞,殷玉和,吳叢梅

( 1.長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,長春 130012；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

人源抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)的受體結(jié)合,刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)形成新生血管,使腫瘤持續(xù)生長[1-4].抗VEGF單克隆抗體通過中和VEGF因子,阻斷其與內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF受體結(jié)合,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移[5-7].因此,抗VEGF抗體成為抗腫瘤血管治療的重要研究方向.這類新藥可通過阻斷微血管的形成和生長達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長或維持腫瘤處于休眠期的目的.目前VEGF抗體藥物對肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等血管生成具有較好的阻斷作用[8],作為新藥研發(fā)的主要靶標(biāo)已引起人們廣泛關(guān)注[9-10].

本文先獲得人源化抗VEGF抗體可變區(qū)蛋白序列,通過密碼子優(yōu)化得到其DNA序列,再與人源抗化VEGF抗體恒定區(qū)DNA序列連接,并在其前端設(shè)計信號肽,得到多條人源化抗VEGF抗體重鏈輕鏈序列,其中一對表達(dá)量和生物效應(yīng)較好,可進(jìn)一步擴大培養(yǎng).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HEK-293,HEK-293F,C6細(xì)胞由長春工業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物實驗室保存,常規(guī)培養(yǎng);pcDNA3.1+質(zhì)粒由長春工業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物實驗室保存;質(zhì)粒大提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑(美國 Polysciences公司)；內(nèi)切酶(大連Tokava生物技術(shù)公司)；辣根過氧化物酶(HRP)兔抗人IgG(北京索萊寶公司)；標(biāo)準(zhǔn)品(美國Roche公司)；培養(yǎng)基,血清(美國Gibco公司).

酶標(biāo)儀(model680型美國BIO-RAD公司)；Transwell小室(美國Corning公司).

1.2 方 法

1.2.1 HEK-293F瞬時轉(zhuǎn)染 HEK-293F細(xì)胞以0.8×106個/mL接種,123 mL懸浮培養(yǎng).20 μg質(zhì)粒與60 μg PEI室溫孵育15～20 min,將其混合液混勻快速加入細(xì)胞懸液中,同時設(shè)空白對照組和pcDNA3.1+載體對照組.培養(yǎng)24 h可檢測轉(zhuǎn)染效率,分別在48,96,144 h后加入補料培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞存活率降至約60%時,離心收取細(xì)胞上清液,純化.

1.2.2 抗體蛋白分離純化 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞,轉(zhuǎn)染不同時間后細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)Protein A親和層析柱純化.細(xì)胞表達(dá)上清液樣品進(jìn)行離心及0.45 μm濾膜過濾.用10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4,0.15 mol/L NaCl,pH=7.0)平衡層析柱,流速為1 mL/min.最后加入洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液,pH=2.7)洗脫.用4 mL EP管收集洗脫的樣品,每管2.4 mL,每EP管內(nèi)需預(yù)先加入中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl,pH=9.0) 600 μL,進(jìn)行收集.

1.2.3 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá) pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞,pCDNA3.1+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對照組.轉(zhuǎn)染48 h后取等量細(xì)胞蛋白上清液,進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后將分離膠置于考馬斯亮藍(lán)溶液中染色,染色30 min后,加脫色液脫色至背景無色,保存干膠.SDS-PAGE電泳圖中蛋白通過Quantity One軟件進(jìn)行純度測定.

1.2.4 細(xì)胞共培養(yǎng) 六孔板內(nèi)接種C6細(xì)胞(3×105個/孔),同時將HEK-293細(xì)胞接種于0.45 μm的Transwell小室.C6細(xì)胞貼壁后,將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后6 h與C6細(xì)胞共培養(yǎng).同時設(shè)pCDNA3.1+質(zhì)粒對照組,培養(yǎng)48 h后用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖.

1.2.5 抗體蛋白活性檢測 六孔板內(nèi)接種C6細(xì)胞(3×105個/孔),細(xì)胞貼壁后,將不同質(zhì)量濃度的蛋白加入細(xì)胞中,同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品對照組和正常細(xì)胞組[5].培養(yǎng)48 h后用MTT法檢測細(xì)胞增殖.

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞增殖 六孔板每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)100 μL,于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3.5 h后終止培養(yǎng).吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加1 mL二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解；用酶標(biāo)儀于570 nm波長測OD值,記錄結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 設(shè)計并優(yōu)化抗VEGF抗體重鏈及輕鏈基因序列

人源抗VEGF抗體可變區(qū)序列為已公開專利中提供的序列(專利號：EP2792687A1),在NCBI網(wǎng)站Ig BLAST在線工具對其進(jìn)行密碼子優(yōu)化,用軟件RNA structure 預(yù)測經(jīng)密碼子優(yōu)化后目的基因二級結(jié)構(gòu),用SingalP3.0信號肽預(yù)測軟件對輕、重鏈可變區(qū)信號肽進(jìn)行分析,與人重鏈和人輕鏈恒定區(qū)DNA序列組裝,并在5′端和3′端分別設(shè)計NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點,得到抗VEGF抗體重鏈和輕鏈各一條.基因由北京君諾德生物技術(shù)有限公司合成.其蛋白序列及基因序列為

重鏈蛋白: MYRIQLLSCIALSLALVTNSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSINGSWIFWVRQAPGKGLEWVGAIWPFGGYTHYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGHSTSPWAMDYWGQGTLVASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;

重鏈DNA: ATGTACCGGATCCAGCTGCTGTCCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGGGGGGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCTGGCTTTTCTATCAATGGCTCCTGGATTTTCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTGGGAGCTATTTGGCCCTTTGGGGGATACACCCATTACGCCGACAGTGTCAAGGGCAGGTTCACCATTTCTGCCGACACCAGCAAGAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATGGGGACACAGCACAAGCCCTTGGGCCATGGACTACTGGGGACAAGGAACACTGGTGGCCAGCACCAAAGGCCCAAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCTCTTCTAAGAGCACCAGCGGAGGTACAGCCGCCCTGGGATGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGTTCTGGCCTGTATTCTCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACTCAGACTTACATCTGTAACGTGAACCACAAACCTTCCAACACCAAGGTGGATAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCATACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGTACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTCTCCCACGAAGATCCCGAAGTGAAATTCAACTGGTACGTCGACGGCGTTGAAGTCCACAACGCCAAAACCAAACCCCGCGAGGAGCAATACAACAGCACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTCAACGGGAAGGAGTACAAATGTAAGGTGAGCAACAAGGCACTGCCCGCCCCTATAGAGAAAACCATCAGCAAAGCCAAGGGACAGCCCAGAGAACCCCAAGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGAGACGAACTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTCACCTGCCTCGTGAAAGGATTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAACCCGAGAACAACTACAAAACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAACTCACCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCTCCCGGCAAGTACTGA;

輕鏈蛋白: MYRIQLLSCIALSLALVTNSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVIRRSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNTSPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;

輕鏈DNA: ATGTACCGGATCCAGCTGCTGTCCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCTCCCTGAGCGCCTCCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCTCCCAGGTTATCAGAAGAAGCCTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAGCTGCTCATCTACGCCGCCTCAAACCTGGCCAGCGGAGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACAGACTTCACCCTCACCATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAATCCAACACCAGCCCCCTGACCTTCGGACAGGGCACCAAAGTCGAAATCAAGAGAACCGTCGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAACAACTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTTGATAACGCCCTGCAGAGCGGCAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAACAGGATAGCAAGGACTCTACCTACTCTCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTCACACACCAAGGCCTGAGCAGCCCCGTCACCAAAAGCTTCAACCGCGGCGAGTGCTACTGA.

2.2 構(gòu)建表達(dá)載體

將重鏈、輕鏈基因分別連接進(jìn)入pcDNA3.1+表達(dá)載體NheⅠ和EcoRⅠ位點,構(gòu)建成pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體.表達(dá)載體鑒定結(jié)果如圖1所示.由圖1可見: pcDNA-VEGFH表達(dá)載體分別用NheⅠ+EcoRⅠ和BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切,有約700 bp目的條帶；pcDNA-VEGFV表達(dá)載體分別用NheⅠ+EcoRⅠ和BamHⅠ+EcoRⅠ雙酶切,有約250 bp目的條帶.結(jié)果表明，表達(dá)載體構(gòu)建正確.

2.3 VEGF抗體大量表達(dá)特性

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞,用SDS-PAGE方法檢測不同時間蛋白表達(dá)水平,結(jié)果如圖2所示.由圖2可見,50 000,25 000附近可見明顯的蛋白表達(dá)帶,轉(zhuǎn)染后24～144 h均有重鏈和輕鏈蛋白表達(dá).

1：pcDNA-VEGFH/NheⅠ+EcoRⅠ；2：pcDNA-VEGFH/BamHⅠ+EcoRⅠ；3：pcDNA-VEGFH；4：DL10000；5：pcDNA-VEGFV；6：pcDNA-VEGFV/NheⅠ+EcoRⅠ；7：pcDNA-VEGFH/BamHⅠ+EcoRⅠ.圖1 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體酶切鑒定Fig.1 Identification of pcDNA-VEGFH and pcDNA-VEGFV expression vectors

1: Marker；2.對照組；3～8: 分別轉(zhuǎn)染24,48,72,96,120,144 h.圖2 pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV共轉(zhuǎn)染 HEK-293F細(xì)胞上清液蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of HEK-293F cells transfected with pcDNA-VEGFH and pcDNA-VEGFV in cell culture supernate

圖3 共培養(yǎng)對C6細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of co-cultured on proliferation of C6 cells

2.4 重組基因表達(dá)產(chǎn)物活性檢測

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后,與C6細(xì)胞共培養(yǎng).用MTT法檢測C6細(xì)胞的增殖特性,結(jié)果如圖3所示.由圖3可見,pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞并與C6細(xì)胞共培養(yǎng),可顯著抑制C6細(xì)胞增殖(P<0.01).

2.5 VEGF抗體分離純化及檢測

將pcDNA-VEGFH和pcDNA-VEGFV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK-293F細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)96 h,提取上清液,用Protein A親和層析柱純化方法純化.SDS-PAGE檢測蛋白純化結(jié)果如圖4所示.由圖4可見,洗脫后的抗體分別在50 000,25 000附近得到明顯蛋白表達(dá)帶,與抗體輕鏈和重鏈分子量相符,在流川處無目的條帶,表明純度較高.用Protein A親和層析柱純化抗VEGF抗體,以VEGF165蛋白為抗原,以純化的抗VEGF抗體為一抗,并以標(biāo)準(zhǔn)品作為對照,進(jìn)行Western-blot檢測,結(jié)果如圖5所示.由圖5可見,所得抗體與標(biāo)準(zhǔn)品一致.

1: Marker;2: 標(biāo)準(zhǔn)品;3: 原樣;4: 流川;5: 洗脫1;6: 洗脫2.圖4 SDS-PAGE檢測純化蛋白Fig.4 Detection of purified protein by SDS-PAGE

1: Marker;2: VEGF抗體蛋白;3: 空白對照;4: 標(biāo)準(zhǔn)品.圖5 Western-blot檢測純化蛋白Fig.5 Detection of purified protein by Western-blot

2.6 VEGF抗體生物活性檢測

將分離純化獲得的抗體以不同質(zhì)量濃度加入C6細(xì)胞中,48 h后用MTT法檢測細(xì)胞增殖,結(jié)果如圖6所示.由圖6可見: 不同劑量抗體蛋白對C6細(xì)胞增殖均有抑制作用,2～20 μg/mL組抑制作用明顯(P<0.05～0.01);相同劑量的抑制效果與標(biāo)準(zhǔn)品(10 μg/mL)相近.

圖6 不同質(zhì)量濃度抗體對C6細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of different mass concentrations of antibodies on proliferation of C6 cells

綜上,本文首先獲得人源抗VEGF抗體可變區(qū)序列,利用NCBI在線平臺及相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并與信號肽[11-13]、人重鏈和人輕鏈恒定區(qū)DNA序列組裝,得到了多條抗VEGF抗體重鏈和輕鏈[14-16],其中一對表達(dá)效果較好；其次，其用PEI介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞表達(dá)合成抗體蛋白[17-19]，結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為2～20 μg/mL的抗體均可明顯抑制C6細(xì)胞增殖(P<0.05～0.01).標(biāo)準(zhǔn)品與相同劑量實驗組的結(jié)果相似.