郭莉，龔幼蘭，李晶，任茜，郝捷

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2保定市第二醫(yī)院)

慢性腎臟病(CKD)的特征是過量成纖維細(xì)胞活化及增殖，隨后腎臟中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度積累，改變腎臟結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎功能障礙并最終引起腎衰竭。許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可調(diào)節(jié)間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。有證據(jù)表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是高度有效的纖維化細(xì)胞因子[1,2]。TGF-β的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括細(xì)胞質(zhì)Smad2/3磷酸化、與Smad4的復(fù)合物形成及隨后易位至細(xì)胞核[3,4]。此外，TGF-β也被認(rèn)為可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程序[5]。多項(xiàng)研究表明在腎纖維化中拮抗TGF-β途徑可獲得積極的治療效果[6,7]。植物衍生產(chǎn)品及其活性成分是各種疾病藥理學(xué)干預(yù)的重要潛在來源[8]。萊菔硫烷是存在于十字花科蔬菜中的硫基異硫氰酸酯化合物。最近人體研究表明，萊菔硫烷有助于降低某些惡性腫瘤、糖尿病的發(fā)病率[9，10]，并可抑制血小板活化以預(yù)防動(dòng)脈血栓形成[11]。既往萊菔硫烷相關(guān)研究主要集中在抗癌和抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面。2018年10月～2019年5月，本研究觀察了萊菔硫烷對(duì)腎纖維化小鼠模型的抗纖維化作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 雄性瑞士白化小鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量25～30 g，飼養(yǎng)于動(dòng)物護(hù)理設(shè)施中，室溫(25±2)℃，保持12 h黑暗/光照循環(huán)。給動(dòng)物食用水和正常顆粒飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)至少1周。萊菔硫烷(S6317)購(gòu)自Sigma公司?？辜?dòng)蛋白、α-SMA、膠原蛋白Ⅰ、p-Smad2/3、t-Smad2/3、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、TGF-β抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。本研究方案獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 腎纖維化模型制作及分組、給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為Sham組、Sham+SFN組、UUO組、UUO+SFN組，每組8只。用氯胺酮60 mg/kg、甲苯噻嗪16 mg/kg腹膜內(nèi)注射麻醉小鼠。UUO組、UUO+SFN組制作腎纖維化模型，進(jìn)行UUO手術(shù)，將左輸尿管與絲線縫合，同時(shí)保持右腎不受影響。Sham組、Sham+SFN組進(jìn)行手術(shù)但不結(jié)扎輸尿管。手術(shù)后第2天UUO+SFN組、Sham+SFN組腹膜內(nèi)注射萊菔硫烷25 mg/(kg·d)，Sham組、UUO組分別給予同等劑量的生理鹽水，持續(xù)給藥至第14天[12]。實(shí)驗(yàn)第14天心臟穿刺取血并分離血清。

1.3 血肌酐、BUN檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血肌酐和BUN，在M5酶標(biāo)儀上讀取數(shù)據(jù)。

1.4 腎臟質(zhì)量及腎臟指數(shù)測(cè)算 于實(shí)驗(yàn)第14天用頸椎脫臼法處死小鼠并收集腎組織，PBS洗滌，去除腎周脂肪后稱重。將腎臟組織-80 ℃儲(chǔ)存，將一小塊腎臟組織保持在4%中性甲醛中固定過夜。分級(jí)脫水后將組織包埋在石蠟中，切成5 μm的切片，并用HE染色。根據(jù)腎臟纖維化損傷近端小管的分級(jí)量表(0～4級(jí))進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估[13]。

1.5 腎損傷及腎纖維化程度觀察 使用切片機(jī)切取5 μm厚的腎標(biāo)本切片，隨后進(jìn)行HE染色，并進(jìn)行損傷評(píng)分[13,14]，從0(無傷害)到3(嚴(yán)重傷害)劃分等級(jí)。Masson三色染色法測(cè)算腎間質(zhì)纖維化面積。采用PSR染色評(píng)價(jià)間質(zhì)膠原沉積情況，IHC染色聯(lián)合Image J軟件觀察并分析膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達(dá)。

1.6 腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)，使用Image J軟件對(duì)顯影的印跡進(jìn)行光密度定量，用肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血肌酐、BUN水平比較 UUO組小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham組，UUO+SFN組血肌酐、BUN水平低于UUO組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組血肌酐、BUN水平比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

2.2 各組腎臟質(zhì)量、腎臟指數(shù)比較 UUO組腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)低于Sham組，UUO+SFN組腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)高于UUO組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.05。

2.3 各組腎損傷及腎纖維化程度比較 HE染色顯示UUO組小鼠腎小管萎縮，刷狀緣喪失，UUO+SFN組較UUO組上皮細(xì)胞空泡化改善。UUO組腎小管損傷評(píng)分高于Sham組，UUO+SFN組腎小管損傷評(píng)分低于UUO組(P均<0.01)。Masson三色染色顯示，UUO組纖維化面積高于Sham組，UUO+SFN組纖維化面積低于UUO組(P均<0.01)。見圖1、表3。PSR染色顯示UUO組間質(zhì)膠原沉積顯著，UUO+SFN組膠原沉積明顯減少。UUO組PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達(dá)高于Sham組，UUO+SFN組PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達(dá)低于UUO組(P均<0.01)。見圖2、表3。

注：A為HE染色顯微鏡下圖片；B為Masson三色染色顯微鏡下圖片。

圖1各組小鼠腎組織HE染色、Masson三色染色鏡下顯示圖像

圖2 各組小鼠腎小管間質(zhì)纖維化、膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達(dá)情況

表3 各組腎小管損傷評(píng)分、纖維化面積、PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

2.4 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達(dá)比較 UUO組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對(duì)表達(dá)量高于Sham組，UUO+SFN組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對(duì)表達(dá)量低于UUO組(P均<0.01)。見圖3、表4。

圖3 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達(dá)情況

3 討論

腎纖維化的特征在于ECM的過量產(chǎn)生導(dǎo)致腎功能逐漸受損。雖然纖維化疾病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但目前仍然沒有藥物有效干預(yù)其進(jìn)展。腎臟中過量基質(zhì)沉積產(chǎn)生機(jī)械拉伸，滲透壓應(yīng)力，募集炎癥細(xì)胞并增強(qiáng)導(dǎo)致腎損傷和纖維化的不同信號(hào)級(jí)聯(lián)。多項(xiàng)證據(jù)表明，萊菔硫烷是一種抗癌化合物[19, 20]。萊菔硫烷是一種天然存在的異硫氰酸鹽，在某些十字花科蔬菜中含量很高。L-萊菔硫烷是具有生物活性的異構(gòu)體，而D，L-萊菔硫烷是L-萊菔硫烷的合成外消旋類似物。同時(shí)，萊菔硫烷是一種具有細(xì)胞保護(hù)作用和抗癌特性的抗氧化劑，已被證明可誘導(dǎo)Ⅱ期酶的活性，如血紅素加氧酶1(HO-1)、醌還原酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽還原酶[10]。據(jù)報(bào)道，萊菔硫烷還可以通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)依賴性Ⅱ期酶的活化來保護(hù)腎臟和大腦免受缺血性損傷[11]。然而，目前對(duì)萊菔硫烷的腎臟保護(hù)活性及抗腎纖維化活性研究較少。

表4 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達(dá)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

UUO誘導(dǎo)的腎纖維化動(dòng)物模型是一種成熟且經(jīng)過驗(yàn)證的模型。本研究制作了UUO誘導(dǎo)的腎纖維化小鼠模型，并給予萊菔硫烷治療，結(jié)果顯示，UUO組腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)低于Sham組，UUO+SFN組腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)高于UUO組；UUO組小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham組，UUO+SFN組血肌酐、BUN水平低于UUO組。肌酐清除率是反映腎功能的最重要參數(shù)之一，血清BUN水平升高表明腎功能降低。本研究結(jié)果表明，使用萊菔硫烷后，腎纖維化小鼠腎功能受損減輕，證實(shí)了萊菔硫烷對(duì)腎臟的保護(hù)作用。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，UUO組腎小管損傷評(píng)分、纖維化面積、PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達(dá)高于Sham組，UUO+SFN組上述指標(biāo)均低于UUO組，提示萊菔硫烷有助于減輕小鼠腎纖維化和腎小管損傷。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β在誘導(dǎo)纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[1]。此外，TGF-β在腎小管細(xì)胞EMT中也起關(guān)鍵作用[16]。由于TGF-β廣泛參與多項(xiàng)生理功能，尚未發(fā)現(xiàn)直接抑制TGF-β可以有效治療纖維化。然而，有研究表明，抑制活化的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有益于延緩不同條件下的纖維化[17,18]。本研究試圖從TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和EMT方面分析萊菔硫烷的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UUO組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對(duì)表達(dá)量高于Sham組，UUO+SFN組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對(duì)表達(dá)量低于UUO組，提示萊菔硫烷對(duì)腎纖維化的干預(yù)作用可能與抑制TGF-β通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。