郭明飛，高家榮，王建青，姜 輝，張 磊，魏良兵

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，安徽合肥230012； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230038）

T2DM是以高血糖為主要特征，以胰島細胞功能受損，胰島素分泌相對不足而引起的內(nèi)分泌紊亂性疾?。?-2］。其具有高血糖、葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗等特點，同時伴隨糖尿病血管病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病等一系列并發(fā)癥［3］，發(fā)病率已成為除心血管疾病和腫瘤之外的第三大非傳染性疾?。?］。黃地安消膠囊由葛根、麥冬、黃連、生地等6味中藥組成，具有清熱潤燥、養(yǎng)陰生津之功效，能抑制炎癥反應(yīng)，改善胰島細胞功能，減輕糖尿病癥狀［5］。臨床應(yīng)用多年對T2DM患者血糖、胰島素抵抗等均具有明顯療效［6-7］。本實驗以GK大鼠為模型，研究黃地安消膠囊對GK大鼠血清TNF-α和Leptin含量的影響以及對IRS-1基因的調(diào)節(jié)作用，探討其改善糖尿病癥狀的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級GK大鼠50只，體質(zhì)量（220±10）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號:SCXK（滬）2012-0002。雄性SPF 級 Wistar大鼠 10只，體質(zhì)量（220±10）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 藥物 按處方比例稱取適量藥材，加10倍量水加熱提取1.5 h，倒出濾液后加8倍量的水加熱提取1 h，合并濾液，靜止24 h后濾去藥液殘渣，濾液經(jīng)濃縮干燥制得干浸膏樣品，灌胃給藥時溶解備用。參芪降糖顆粒，魯南厚普制藥有限公司，批號00115257。

1.1.3 試劑 熒光定量PCR試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RIPA裂解液、DAPI染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于杭州碧云天生物技術(shù)研究所；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 儀器 D3024R型高速冷凍微量離心機，DragonLab公司；GA-3型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；RM2016型病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；JJ-12J型全密封自動脫水機，武漢俊杰電子有限公司；正置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse C1）；7500型熒光定量 PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 選取尾靜脈血測定GK大鼠血糖值，隨機血糖值和糖負(fù)荷2 h血糖值均大于11.1 mmol/L 作為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)［8-10］。選取造模成功的大鼠隨機分為模型組、參芪降糖顆粒組（1.08 g/kg）、黃地安消膠囊組（12 g/kg，6 g/kg，3 g/kg），每組10只，另取10只Wistar大鼠為正常對照組。給藥周期為6 w，給藥期間各組大鼠均自由飲食飲水。

1.2.2 血清TNF-α、Leptin含量檢測 實驗結(jié)束前禁食 12 h，用 3.5%的水合氯醛溶液（1 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后靜置2 h，3500 r/min離心10 min，取上清液，進行指標(biāo)檢測。

1.2.3 胰腺組織免疫熒光染色 取胰腺組織做常規(guī)石蠟包埋，切片、脫蠟、水化等步驟后進行抗原修復(fù)，血清蛋白封閉處理，滴加一抗，4℃條件下孵育過夜，經(jīng)洗滌后，滴加二抗，避光孵育后滴加DAPI復(fù)染細胞核，漂洗，封片處理，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR 技術(shù)檢測脂肪組織 IRS-1 mRNA的表達 取脂肪組織50 mg，Trizol法提取脂肪組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR技術(shù)檢測脂肪組織IRS-1 mRNA的相對表達，以β-actin為內(nèi)參。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot技術(shù)檢測脂肪組織 IRS-1 蛋白的表達 取脂肪組織50 mg，破碎處理后，加蛋白裂解液提取總蛋白，凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉處理，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗進行孵育，洗膜處理后，HRP-ECL發(fā)光法進行鑒定，經(jīng)曝光、定影等處理，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 黃地安消膠囊對大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α，Leptin含量均明顯升高（P＜0.01），表明糖尿病大鼠存在炎癥反應(yīng)；與模型組比較，參芪降糖顆粒組及黃地安消膠囊組大鼠TNF-α、Leptin存在不同程度降低（P＜0.01），表明黃地安消膠囊能夠降低糖尿病炎癥反應(yīng)。結(jié)果見表2。

表2 黃地安消膠囊對大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影響（±s）

表2 黃地安消膠囊對大鼠血清TNF-α、Leptin含量的影響（±s）

注:與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

組別 劑量（g/kg） TNF-α（pg/mL） Leptin（ng/mL）正常組 - 41.69±6.23 4.17±0.51模型組 - 125.50±12.311） 9.95±0.421）參芪降糖顆粒組 1.08 55.09±8.012） 5.79±0.482）黃地安消膠囊高劑量組 12 75.83±6.961） 6.73±0.552）黃地安消膠囊中劑量組 6 45.86±6.592） 5.17±0.392）黃地安消膠囊低劑量組 3 85.34±7.372） 7.15±0.132）

2.2 黃地安消膠囊對大鼠胰島組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠胰島組織結(jié)構(gòu)完整，呈橢圓狀，細胞排列緊密，細胞核清晰可見，呈藍色均勻分布。模型組胰島細胞排列疏松，形態(tài)紊亂，細胞數(shù)目較正常組明顯減少。參芪降糖顆粒組大鼠胰島細胞排列較規(guī)則，細胞數(shù)目較模型組略有增加。黃地安消膠囊各組大鼠胰島細胞數(shù)目較模型組有不同程度增加，細胞排列基本規(guī)則，形態(tài)較完整，無明顯異常現(xiàn)象，結(jié)果見圖1。

圖1 黃地安消膠囊對大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響（×400）

2.3 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1mRNA表達的影響

圖2 IRS-1和β-actin溶解曲線

表3 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1 mRNA表達的影響 （±s）

表3 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1 mRNA表達的影響 （±s）

注:與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

組別 劑量（g/kg） IRS-1正常組 - 1.00±0.05模型組 - 0.63±0.041）參芪降糖顆粒組 1.08 0.75±0.032）黃地安消膠囊高劑量組 12 0.70±0.052）黃地安消膠囊中劑量組 6 0.75±0.042）黃地安消膠囊低劑量組 3 0.69±0.042）

圖3 IRS-1和β-actin擴增曲線

見圖2、圖3，表3。由圖2可知，IRS-1和βactin基因溶解曲線分別在83℃和86℃獲得單一溶解峰，表明在該反應(yīng)條件下，目的基因具有顯著的特異性。由圖3可知，IRS-1和β-actin基因擴增曲線跨度適中，線條光滑圓潤，表明擴增良好。由表3可知，與正常組比較，模型組大鼠脂肪組織中IRS-1mRNA表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃地安消膠囊各組及參芪降糖顆粒組大鼠脂肪組織IRS-1 mRNA表達具有不同程度的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃地安消膠囊中劑量組及參芪降糖顆粒組大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達具有不同程度的升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表4，圖 4。

表4 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達的影響 （±s）

表4 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達的影響 （±s）

注:與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

組別 劑量（g/kg） IRS-1正常組 - 1.28±0.07模型組 - 0.77±0.031）參芪降糖顆粒組 1.08 0.93±0.062）黃地安消膠囊高劑量組 12 0.71±0.04黃地安消膠囊中劑量組 6 1.07±0.062）黃地安消膠囊低劑量組 3 0.38±0.03

圖4 黃地安消膠囊對大鼠脂肪組織IRS-1蛋白表達的影響

3 討論

糖尿病是一種臨床常見的慢性病、多發(fā)病，具有高血糖的顯著特征，同時易引起糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病視網(wǎng)膜病變和血管病變等一系列并發(fā)癥。其發(fā)病機制復(fù)雜多樣，多與遺傳、自身免疫、環(huán)境因素、飲食、精神等因素相關(guān)［11］。GK 大鼠為非肥胖型T2DM模型，具有和人類糖尿病相似的高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特征，已成為研究 T2DM 的理想模型［12］。

機體在高血糖狀態(tài)時易引發(fā)體內(nèi)的炎癥因子產(chǎn)生反應(yīng)，誘發(fā)感染等效應(yīng)，其中以炎癥因子TNF-α和Leptin升高較為顯著［13-14］。由實驗結(jié)果可知，黃地安消膠囊對上述炎癥因子具有明顯的降低作用，表明其能夠在一定程度上抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低機體發(fā)生感染的風(fēng)險。

胰島素經(jīng)分泌入血后，隨血液循環(huán)到達脂肪、肝臟、骨骼肌等靶組織或靶器官，與細胞膜表面的胰島素受體相結(jié)合，引發(fā)胰島素信號傳遞的級聯(lián)反應(yīng)，促進組織細胞對葡萄糖的吸收和利用，降低體內(nèi)血糖含量［15］。在這一信號傳遞過程中IRS-1作為胰島素信號通路的首要蛋白分子，直接決定著胰島素與受體底物結(jié)合的強弱。在正常大鼠體內(nèi)IRS-1mRNA和蛋白含量呈正性表達［16］。當(dāng)機體出現(xiàn)胰島素抵抗或者血糖升高時，IRS-1基因表達明顯降低，胰島素信號通路傳遞受阻，外周細胞對葡萄糖消耗減少，機體出現(xiàn)高血糖狀態(tài)，從而加重糖尿病癥狀［17］。本實驗結(jié)果表明，黃地安消膠囊能夠促進GK大鼠脂肪組織IRS-1mRNA和蛋白表達，增強機體對胰島素的敏感性，促進機體對血糖的利用，改善T2DM癥狀。

綜上所述，黃地安消膠囊能夠降低糖尿病模型GK大鼠炎癥因子含量，增強胰島素信號通路受體底物IRS-1的基因表達，促進胰島素信號通路活性，從而增強機體對葡萄糖的利用，降低血糖水平，改善糖尿病癥狀。