孫勛勛 周軼楠 黃吉雷

摘要 桑樹病毒病一直是影響蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，但其病原也尚未完全確認(rèn)。本研究收集全國不同桑園、不同時間和不同品種的皺縮狀和花葉狀桑葉樣品，分離病毒后使用透射電子顯微鏡觀察病毒形態(tài)特征。結(jié)果在桑病葉中分離獲得兩種病毒，一種為雙聯(lián)體形態(tài)病毒，長（27.84±1.71）nm，寬（17.05±1.13）nm，形態(tài)特征與雙生病毒屬的病毒形態(tài)特征一致;另一種為球狀體病毒（80～100 nm），形態(tài)特征與番茄斑萎病毒屬的病毒形態(tài)特征一致;桑葉切片觀察，發(fā)現(xiàn)同一桑葉材料中存在這兩種病毒。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)其存在?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒Mulberry mosaic dwarf associated virus （MMDaV）和桑脈帶相關(guān)病毒Mulberry vein banding associated virus （MVBaV）。設(shè)計上述病毒的特異引物，對158份桑病葉進(jìn)行PCR檢測，MMDaV的檢出率為93.04%;而MVBaV為60.13%，同時檢出率為57.59%。結(jié)果表明，MMDaV和MVBaV在桑病葉中普遍存在，且同時存在。本研究首次在桑樹病葉中同時觀察并檢測到MMDaV和MVBaV，二者在桑皺縮狀和花葉狀的桑葉中存在混合感染的現(xiàn)象，研究結(jié)果將為今后深入研究桑病毒病及防控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 桑樹病毒病; 桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒; 桑脈帶相關(guān)病毒; 形態(tài)特征; PCR檢測

中圖分類號： S 432.4+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018419

Abstract Mulberry viral disease is one of the most important factors affecting the development of sericultural industry， but the pathogens of mulberry viral disease have been long unclear. In this study， two viruses were isolated from the diseased mulberry leaf samples with crinkle or mosaic leaf symptoms collected from different varieties and different sericultural regions in China at different time and further examined by transmission electron microscope. One virus showed similar morphological features to geminivirus， and the length of virus particles was （27.84±1.71）nm and width was （17.05±1.13）nm. Another was a globular virus with the length between 80 and 100 nm and showed similar morphological features to Tospovirus. Both virus particles were observed in one mulberry leaf， and Mulberry mosaic dwarf associated virus （MMDaV） and Mulberry vein banding associated virus （MVBaV） were detected through high-throughput sequencing. Furthermore，158 diseased mulberry leaf samples of mulberry leaf were detected by specific identification PCR.The detection rates of MMDaV and MVBaV were 93.04% and 60.13%， respectively， and the detection rate of both was 57.59%. This was the first report that MMDaV and MVBaV were detected to coexist in the diseased mulberry leaf， which will provide a foundation for future study of mulberry viral diseases.

Key words mulberry viral disease; Mulberry mosaic dwarf associated virus; Mulberry vein banding associated virus; morphological character; PCR detection

桑樹為木本植物，屬薔薇目Rosales、?？芃oraceae、桑屬Morus。隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型發(fā)展，桑樹從傳統(tǒng)的單一養(yǎng)蠶植物，逐漸成為多功能、多產(chǎn)品的植物資源[1-2]，因此桑葉質(zhì)量也越來越被關(guān)注。桑樹病害是影響桑葉質(zhì)量的重要因素之一，其中植物病毒對桑樹的危害也一直未被解決。至今，已報道的桑樹病毒有桑環(huán)斑病毒Mulberry ringspot virus、?；ㄈ~病毒Mulberry mosaic virus、桑壞死病毒Mulberry necrosis virus、桑潛隱病毒Mulberry latent virus、桑脈帶相關(guān)病毒Mulberry vein banding associated virus、?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒Mulberry mosaic dwarf associated virus、桑花葉卷葉相關(guān)病毒Mulberry mosaic roll leaf associated virus和桑桿狀DNA病毒1 Mulberry badnavirus 1等。其中，只有桑環(huán)斑病毒、桑花葉卷葉相關(guān)病毒、?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒和桑桿狀DNA病毒1四種被國際病毒分類委員會（ICTV）收錄，但它們與桑樹癥狀之間的確切關(guān)系尚未確定。

有關(guān)桑樹病毒病的報道最早出現(xiàn)于1936年，當(dāng)時統(tǒng)稱為?；ㄈ~病。20世紀(jì)60年代后，隨著病毒分離、分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)桑樹病毒的分離和鑒定的研究報道才逐漸多了起來。1971年，Tsuchizaki 等在帶有環(huán)斑狀和絲葉狀的病葉中分離并在切片中觀察到一種球狀病毒（直徑22 nm）[3]。1976年，Tsuchizaki 等又從花葉等系統(tǒng)性褪綠斑的病葉中分離出另一種線型病毒（長約700 nm）[4]; 1983年，舒秀珍等從系統(tǒng)性褪綠褐色環(huán)斑狀的桑葉中分離到一種球形病毒（直徑約26 nm）[5]。1988年，陳俊英等連續(xù)三年從絲狀和花葉狀的桑葉中分別分離出一種線形病毒（長600～700 nm，寬11～12 nm）[6]; 1988年，張月季等從表現(xiàn)大斑塊花葉的桑葉中分離一種球形病毒（直徑25～30 nm）[7]; 2014年，Marei等從花葉、黃葉和畸形等癥狀的桑葉中發(fā)現(xiàn)一種雙生病毒（雙聯(lián)體長57 nm）[8]。雖然在桑樹中分離并觀察到各種不同的病毒，但很難鑒定病毒的種類，即使電鏡觀察也不能完全反映病毒的真實特征。

分子生物學(xué)手段是研究桑樹病毒病的重要方式。近5年來，利用分子生物學(xué)手段，桑樹中的病毒不斷被發(fā)現(xiàn)。2013年，Elbeaino等從花葉狀和脈帶狀的桑葉中分離觀察到一種桑桿狀DNA病毒1（150 nm×30 nm），并通過簡并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）檢測到DNA桿狀病毒1的序列[9]。2014年，盧全有在桑病毒病葉片中分離到?；ㄈ~卷葉病相關(guān)病毒（28～30 nm），并結(jié)合各種分子生物學(xué)方法鑒定該病毒屬于線蟲傳多面體病毒屬[10]。2015年，Meng 等在花葉和絲葉狀的桑葉中觀察到一種球狀病毒，并通過高通量測序發(fā)現(xiàn)桑脈帶相關(guān)病毒[11]。2015年，Ma 等通過高通量測序等分子手段在帶有花葉和皺縮狀的桑葉中檢測?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒[12]，Lu 等也在皺縮的桑葉中檢測到桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒[13]。2016年，Chiumenti等通過高通量測序在帶有環(huán)斑及黃脈的病葉中發(fā)現(xiàn)桑桿狀DNA病毒1[14]。分子生物學(xué)手段結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于桑樹病毒的研究上，并且高通量測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于快速檢測木本植物病毒上[15]。本文結(jié)合病毒顯微觀察、高通量測序和PCR檢測技術(shù)對桑樹病毒進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

收集的桑病葉主要有3種癥狀類型（圖1）： 1）葉片表現(xiàn)為皺縮畸形（圖1a）。2）葉片花葉，帶有褪綠斑（環(huán)斑的圖1b和大斑塊的圖1c）。3）葉片表現(xiàn)為褪綠和畸形兩種癥狀的花葉皺縮狀（圖1d）。

供試的桑病葉材料采集地點主要有兩類。一類收集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶桑教學(xué)實踐園（簡稱桑園），包括不同時間從不同桑品種上采集的桑病葉樣品，共計115份，其中2017年4月采集52份、2017年9月到11月采集的26份，2018年2月采集的37份。另一類為采集于廣東、廣西、海南和重慶4個省區(qū)共16個縣市（圖2）收集的43份桑病樣。各地采集的具體時間、地點和癥狀信息見表1～2。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離純化及超薄切片的制作

?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒的分離純化方法： 1） 桑病葉50 g，加入2 mL/g的緩沖溶液（0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液，pH 6.0，5 mL/L β-巰基乙醇），打碎過濾。2） 濾液氯仿乳化（1 mL/3 g葉片），10 000 g離心10 min，取上清。 3） 加入固體聚乙二醇6000 （70 g/L）和氯化鈉（0.2 mol/L），4℃下攪拌3 h，10 000 g離心25 min，去上清。4） 加入0.1 mol/L檸檬酸緩沖液懸浮，4℃放置24 h。5） 10 000 g離心30 min，取上清，重復(fù)兩次。6） 加入10%氯仿，混勻，10 000 g離心30 min，取上清。加入到10%～40%的蔗糖密度梯度離心，300 000 g離心1 h。取懸浮病毒帶，302 000 g沉降離心1.5 h，懸浮沉淀，獲得純的病毒懸浮液，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

桑脈帶相關(guān)病毒粗懸液的制備： 1） 桑病葉50 g，加入3 mL/g的緩沖液（0.1 mol/L磷酸鈉緩沖溶液，pH 7.0，5 mL/L β-巰基乙醇），打碎過濾。2） 濾液10 000 g離心15 min。3） 去上清，加入3 mL/g的緩沖液，使用小研杵和磁力攪拌器將沉淀物輕輕混勻30 min。4） 8 000 g離心15 min澄清，收集上清液100 000 g離心30 min，去上清。5） 沉淀中加入2.5 mL緩沖溶液，加入到10%～40%蔗糖梯度離心，70 000 g離心45 min，收集含有病毒顆粒的乳白色帶。6） 加入1∶1的緩沖液稀釋，100 000 g離心1 h濃縮。7） 將病毒顆粒的沉淀以約1 mg/mL的濃度重懸浮于無菌雙蒸水中。

桑病葉超薄切片觀察： 1）桑病葉樣品切片，使用0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗4次，每次15 min，注射器抽出葉片中的空氣。2）桑病葉樣品用5%戊二醛4℃固定過夜，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）漂洗4次，每次15 min。3）1%的鋨酸固定過夜，磷酸緩沖液漂洗4次，每次15 min。4）依次使用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脫水各10 min、100%乙醇脫水兩次，每次15 min，100%的丙酮脫水兩次，每次15 min。5）丙酮/樹脂不同比例滲透（3∶1 4 h，1∶1 17 h，1∶3 8 h，純樹脂24 h），70℃聚合24 h。6）包埋塊切成70 nm的超薄切片。

1.2.2 桑樹中病毒的形態(tài)學(xué)觀察

病毒離心液負(fù)染觀察： 碳膜銅網(wǎng)吸附病毒懸浮液5 min，再用2%的醋酸雙氧鈾負(fù)染2 min，樣品干燥后置于120 kV透射電鏡下觀察。

超薄切片觀察： 超薄切片經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，樣品干燥后置于120 kV透射電鏡下觀察。

1.2.3 桑葉總DNA的提取

采用改良的CTAB法抽提植物基因組DNA。將研磨后的材料0.05 g粉末加入1.5 mL EP管中，加入2% CTAB（含0.1% β-巰基乙醇）緩沖液600 μL重懸，振蕩混勻，65℃水浴3～4 h; 冷卻后，加入等體積酚/氯仿，振蕩混勻5 min，12 000 r/min，離心5 min，取水相上清; 加入400 μL氯仿抽提1次，取上清; 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻數(shù)次，4℃放置1 h以上，將全部液體吸入到核酸純化吸附柱套件中，12 000 r/min，30 s過濾，棄濾液; 用70%乙醇500 μL洗滌，12 000 r/min，30 s過濾兩次，最后空離1次; 將吸附柱放置一新的EP管中，加30 μL ddH2O溶解DNA，使用核酸微量分光光度計檢測核酸質(zhì)量，檢測合格后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 桑葉總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

使用Magen的RNA提取試劑盒（HiPure Plant RNA Mini Kit）提取桑葉總RNA，并使用核酸微量分光光度計檢測質(zhì)量，檢測合格使用TaKaRa反轉(zhuǎn)試劑盒合成cDNA置于-20℃?zhèn)溆?，總RNA置于-80℃儲藏。

1.2.5 高通量測序及PCR檢測

將皺縮狀和花葉狀桑葉分別送廣州瑞科基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序和基因組DNA高通量測序。

桑脈帶相關(guān)病毒的RT-PCR檢測，根據(jù)桑脈帶相關(guān)病毒核殼體蛋白核苷酸序列（KM819701.1）設(shè)計篩選獲得引物： 上游引物S2776F： 5′-CATAGCATCAGCCTCAA-3′; 下游引物S3225R： 5′-GT-CTACCGTCCGTCAGC-3′。反應(yīng)體系20 μL，包括2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，桑病葉總DNA模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒的PCR檢測，檢測特異引物為MCP746F/MCP1148R[16]。上游引物MCP746F：5′-CGAGTTTGGCAAGAAGGAAGAG-3′;下游引物MCP1148R： 5′-TTGGCTCCCACTAA-ATGAAAGG-3′。反應(yīng)體系20 μL，包括2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，桑病葉總DNA模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，PCR條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹病毒的形態(tài)特征

分別從不同癥狀的桑葉中分離純化病毒，病毒懸浮液復(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察（圖3），從皺縮、花葉和攜帶兩種癥狀的三類桑葉中均能分離到雙聯(lián)體形態(tài)的病毒粒子（圖3a～b箭頭所示）;隨機選取其中20個單病毒粒子以及20個雙聯(lián)體病毒粒子，使用明美顯微數(shù)碼分析系統(tǒng)測量病毒大小，20個雙聯(lián)體病毒粒子的平均直徑為（27.84±1.71）nm，20個單體平均直徑為（17.05±1.13）nm。另外，從花葉狀和攜帶兩種癥狀的桑葉中還分離到一種被囊泡包裹的球狀病毒（圖5a），其大小約為（80～100）nm。

對不同癥狀的桑葉組織切片的電鏡觀察顯示（圖4a～c、圖5b），在帶有皺縮和花葉兩種癥狀的桑葉中觀察到雙聯(lián)體病毒和球狀病毒。桑葉細(xì)胞如同自噬般萎縮成葫蘆狀，難以分辨細(xì)胞器及組成，細(xì)胞內(nèi)所有的黑色范圍均聚集大量的病毒顆粒，放大觀察，多個顆粒聚集一起，也存在明顯的雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)，大小約為17 nm×28 nm（圖4a～c），該結(jié)果與分離的雙聯(lián)體病毒粒子形態(tài)一致。另外，還有些細(xì)胞無明顯的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，且分布著一些被200～400 nm囊泡包裹的球狀體，大小約為80～100 nm，這與分離的球狀病毒粒子形態(tài)相同。

2.2 桑病葉高通量測序分析

高通量檢測結(jié)果（表3）所示，在皺縮樣品中檢測到的DNA病毒序列，對比到的DNA病毒僅有桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒（MMDaV），占所有可讀序列的0.001 8%;在花葉樣品中檢測到的RNA病毒序列，對比到的RNA病毒僅有桑脈帶相關(guān)病毒（MVBaV），占所有可讀序列的0.490 8%，未發(fā)現(xiàn)其他病毒。

2.3 PCR檢測桑樹中的病毒

2.3.1 兩種桑樹病毒的PCR檢測結(jié)果

利用特異性引物MCP746F/MCP1148R，對?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒（MMDaV）進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示：桑病葉樣品總DNA中均存在大小約為400 bp的條帶（圖6：泳道1～9），空白對照則沒有出現(xiàn)反應(yīng)條帶（圖6），說明PCR反應(yīng)體系沒有污染，但泳道10沒有出現(xiàn)目的條帶，可能該樣本不存在MMDaV病毒基因（圖6）。將PCR陽性結(jié)果送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與DNA病毒MMDaV序列相似度高達(dá)97%，說明桑病葉材料中存在MMDaV。

利用特異性引物S2776F/S3225R對桑脈帶相關(guān)病毒（MVBaV）進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果（圖7）顯示，泳道3～9桑病葉樣品總DNA存在大小為450 bp左右的條帶，空白對照11號泳道無條帶，說明不存在污染，泳道1、2和10均無條帶，可能樣品中不存在目的病毒。將450 bp左右的RT-PCR結(jié)果送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果與RNA病毒MVBaV相似度高達(dá)99%，說明桑病葉樣品中存在MVBaV。

2.3.2 不同桑葉樣品中MMDaV和MVBaV檢出率分析

對采集于不同時間、不同品種和不同地理位置的桑病葉中兩種病毒進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果（圖8）顯示，158份桑病葉樣品MMDaV的檢出率為93.04%（147/158）， MVBaV的檢出率為60.13%（95/158），共同檢出率達(dá)57.59%（91/158）。102份表現(xiàn)花葉的桑葉中桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒（MMDaV）的檢出率為95.10%（97/102），桑脈帶相關(guān)病毒（MVBaV）的檢出率為65.69%（67/102），共同檢出率高達(dá)64.71%（66/102）; 128份表現(xiàn)皺縮的桑葉中MMDaV的檢出率為92.97%（119/128）， MVBaV的檢出率為61.72%（79/128），共同檢出率達(dá)58.59%（75/128）。72份同時攜帶兩種癥狀的桑葉中MMDaV檢出率為95.83%（69/72），MVBaV的檢出率為70.83%（51/72），共同檢出率達(dá)69.44%（50/72）。

3 討論

Ma等在桑葉中發(fā)現(xiàn)?；ㄈ~型萎縮病相關(guān)病毒（MMDaV），并通過分子生物學(xué)分析認(rèn)為該病毒屬于雙生病毒科病毒，但不屬于現(xiàn)有的分類屬[12]，但他并未觀察到病毒的形態(tài)特征。本研究首次從皺縮狀、花葉狀和攜帶兩種癥狀的三種桑葉中分離到雙聯(lián)體形態(tài)的病毒粒子，長（27.84±1.71） nm，寬（17.05±1.13） nm，該病毒粒子與雙生病毒科病毒（20 nm×30 nm）的大小和形態(tài)特征[17-18]一致。另外，從花葉和攜帶花葉及皺縮兩種癥狀的桑葉中還分離到一種被囊泡（200～400 nm）包裹的球狀病毒，其大小約為（80～100） nm，這與Meng等在桑葉組織切片中觀察到的球狀體病毒類似[11]，與番茄斑萎病毒屬的病毒形態(tài)一致[19]，后者也存在明顯的囊泡結(jié)構(gòu)。對桑葉進(jìn)行切片觀察，在帶有花葉和皺縮兩種癥狀的桑葉中同時觀察到雙聯(lián)體形態(tài)病毒和球狀病毒。對兩種桑病葉中的DNA及RNA進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)皺縮癥狀的桑葉中檢測到MMDaV，而花葉癥狀的桑葉中檢測到MVBaV，通過高通量測序也進(jìn)一步確定了桑病葉中存在這兩種病毒。PCR檢測均能在桑葉樣品中發(fā)現(xiàn)這兩種病毒，并且這兩種病毒能在同一桑樹病葉材料中被檢測到。

分析不同時間、品種和地理位置的桑病葉中MVBaV和MMDaV兩種病毒的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在158份桑病葉中，MMDaV的檢出率為93.04%;MVBaV的檢出率為60.13%;兩種病毒同時檢出率為57.59%。這表明MMDaV和MVBaV在桑病葉中普遍存在，并且同一桑葉中存在這兩種病毒的現(xiàn)象也很普遍。Meng等[11]在2015年從脈帶、環(huán)斑和絲葉等花葉癥狀的桑葉中發(fā)現(xiàn)MVBaV，并獲得MVBaV的全基因組[11]，我們的結(jié)果進(jìn)一步表明MVBaV與桑病毒病有關(guān)。2015年，馬宇欣采自陜西安康學(xué)院的92份桑病樣中MMDaV的檢出率高達(dá)92.4%，線蟲傳多面體病毒為52.17%，兩種病毒存在混合感染的現(xiàn)象[20]，并且在辣椒[21]、甜瓜[22]、番茄[23]等經(jīng)濟作物上均存在混合感染的情況，說明病毒的混合感染非常普遍。本研究也發(fā)現(xiàn)了桑葉中兩種病毒混合感染的現(xiàn)象。

本研究首次從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)桑園及來自4個省區(qū)不同桑園的桑病葉中檢測到MMDaV和MVBaV兩種病毒，這兩種病毒普遍存在于花葉和皺縮癥狀的桑葉中，且存在混合感染現(xiàn)象。因此在桑樹病毒的研究中，需要考慮多種病毒混合感染情況;在病毒防治方面，也需要考慮對多種病毒進(jìn)行防治，以加強防病和治療的效果。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）