蔣南洋，劉瑋欣，劉賢賢*，張業(yè)

(1.桂林師范高等?？茖W(xué)校 化學(xué)與藥學(xué)系，廣西 桂林 541001；2.北京中科英曼環(huán)境監(jiān)測有限公司，北京 100041; 3.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541100；)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)系雙子葉植物綱胡桃科植物，花期4～5月，果期7～9月[1],屬于國家重點保護(hù)植物，被譽為“活化石”,具有生津消渴、清熱解毒、降壓強心之功效，實驗證明：青錢柳降糖組方對Ⅱ型糖尿病大鼠高血糖癥狀和糖耐受情況有改善作用,對胰島組織有保護(hù)作用[2]，可以抑制葡萄糖的吸收，從而預(yù)防由高血糖引起的一系列病癥[3]。

許多的研究表明：青錢柳葉含有多種藥理活性的化學(xué)成分，如黃酮類[4]、三萜皂苷類、香豆素類等。

黃酮類化合物是具有多種生物活性的多酚類化合物[5]，具有很好的防治血栓、抗衰老、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能等生物活性[6-7]。作為青錢柳葉的重要活性成分，黃酮類化合物的提取、測定及純化對青錢柳資源的開發(fā)利用具有重大的研究價值和意義。

近幾年對青錢柳總黃酮提取工藝主要在提取溶劑等單因素方面研究頗多。但通過數(shù)學(xué)建模方法，進(jìn)行青錢柳中總黃酮成分提取的多因素影響的優(yōu)化研究還未見報道。筆者通過數(shù)學(xué)建模的方法進(jìn)行響應(yīng)曲面法動力學(xué)試驗，對廣西青錢柳老葉黃酮類化合物生產(chǎn)工藝的優(yōu)化研究，將促進(jìn)青錢柳產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，進(jìn)一步豐富青錢柳在醫(yī)藥方面的功能，開辟一條經(jīng)濟(jì)環(huán)保高附加值產(chǎn)業(yè)化的新道路。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

材料：青錢柳老葉采自廣西桂林伯林生物技術(shù)有限公司，采后清洗干燥后備用。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(AR)、無水乙醚、亞硝酸鈉、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為AR試劑。

儀器：SPECORD 200型德國耶拿紫外可見分光光度計、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器、80-2型離心沉淀機(jī)、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、JA2003N型電子天平，HH—4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取青錢柳老葉粉碎成粉末過40目篩，稱取100 g，用500 mL乙醚液冷凝回流脫脂20 h，過濾取出樣品，自然風(fēng)干2 h后，移入烘箱中，設(shè)置溫度103 ℃，時間2 h，稱重備用。

1.2.2 總黃酮提取液的制備

精確稱取10 g脫脂樣品，分別用濃度為65 %、80 %、95 %的乙醇在不同溫度條件下，采用不同頻率超聲波浸提，第1次浸提固液比為1∶3(g∶mL)，時間為2 h；第2次浸提固液比為1∶2(g∶mL)，時間為1 h；第3次固液比為1∶2(g∶mL)，時間為30 min，合并3次提取液，冷卻后移入250 mL容量瓶，定容后待測。

1.2.3 總黃酮含量的測定

量取5 mL脫脂青錢柳老葉總黃酮類化合物提取液，用3 000 r/min離心機(jī)離心分離20 min，用移液槍精確吸取上層清液0.5 mL移入10 mL的容量瓶中，各加5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置一段時間，加入10 %硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入4 %氫氧化鈉溶液4 mL，加蒸餾水，搖勻，放置15 min后，以試劑空白做對照，用分光光度計在510 nm波長處測其吸光度[8-10]。

1.2.4 青錢柳老葉總黃酮類化合物含量的計算

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相當(dāng)于樣品吸光度的蘆丁含量，按下式求出青錢柳老葉總黃酮含量(以蘆丁計)。

式中，X為樣品中總黃酮含量(以蘆丁計)，m1為待測液中總黃酮的量,mg，m為樣品質(zhì)量,g，v1為測定樣品提取液體積,mL，v2為樣品提取液總體積,mL[9-11]。

1.3 蘆丁(蕓香葉苷)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取在105 ℃條件下烘至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，用70 %乙醇定容至100 mL，搖勻，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(每1 mL標(biāo)準(zhǔn)液含蘆丁0.1 mg)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用移液槍移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL(相當(dāng)于蘆丁0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg)，置入6支10 mL容量瓶中，加5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加4 %氫氧化鈉溶液4 mL，加蒸餾水，搖勻，放置15 min后，用分光光度計測其吸光度。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸光度曲線圖

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線見圖1。

由圖1可得，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程y=0.081 8x-0.003 4和復(fù)相關(guān)系R2=0.999 9，表明該回歸曲線具有統(tǒng)計學(xué)意義，能較好地擬合實際情況。

2.2 響應(yīng)面法動力學(xué)試驗

選擇乙醇含量(A)、溫度(B)、超聲頻率(C)三個因素，吸光度和總黃酮含量為響應(yīng)值，原料液為青錢柳老葉黃酮提取液，進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗[12,15]，試驗設(shè)計方案和試驗結(jié)果見表1。

表1 試驗設(shè)計方案和試驗結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

采用Design-Expert8.05b對表1中的實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，得出的響應(yīng)曲面二次方程模型方差分析的結(jié)果見表2。

表2 動力學(xué)方程方差分析表

由表2可以看出，P<0.000 1，說明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。并且自變量一次項A，二次項A2、B2、C2為顯著影響因子(P<0.000 1)和復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4，說明該方程與實際情況擬合良好，能準(zhǔn)確反映乙醇含量、溫度、超聲頻率與總黃酮含量的關(guān)系。經(jīng)過回歸擬合之后得到總黃酮含量V與各因子之間的動力學(xué)方程如下：

V=6.31-1.36A-4.75B+0.034C-0.013AB+0.073AC-2.975BC-0.60A2-0.37B2-0.43C2。

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的解析

① 單因素效應(yīng)

因各因素先通過標(biāo)準(zhǔn)化處理，偏回歸系數(shù)將不再受因素取值影響，它絕對值得大小能夠直接反映變量相對響應(yīng)值的影響程度。因此，各因子對吸光度的影響順序為：乙醇含量(A)>超聲頻率(C)>溫度(B)。

② 因素間交互效應(yīng)

根據(jù)擬合的方程利用Design-Expert8.05b軟件作不同因子的響應(yīng)曲面等高線圖，研究乙醇含量、超聲頻率和溫度這三個關(guān)鍵因子及其交互作用對總黃酮含量的影響見圖2～圖4。

圖2 乙醇含量和超聲頻率對總黃酮含量影響的等高線圖

圖3 乙醇含量和溫度對總黃酮含量影響的等高線圖

圖4 超聲頻率和溫度對總黃酮含量影響的等高線圖

③ 數(shù)據(jù)點的分布

根據(jù)擬合的方程利用Design-Expert8.05b軟件，研究殘差、預(yù)測值和試驗實際值等對總黃酮含量的影響效果見圖5～圖7，其中殘差的正態(tài)概率分布，預(yù)測值與試驗實際值都靠近直線，數(shù)據(jù)點分布的線性明顯，沒有出現(xiàn)異常的數(shù)據(jù)點；殘差與方程預(yù)測值的數(shù)據(jù)點較分散且無規(guī)律，進(jìn)一步說明模型擬合度較好，可進(jìn)行后續(xù)分析。

圖5 預(yù)測值與試驗實際值的對應(yīng)關(guān)系

圖6 殘差的正態(tài)概率分布

④ 最大總黃酮含量的工藝參數(shù)

利用響應(yīng)面來設(shè)計實驗，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理，以最大總黃酮含量為響應(yīng)值確定工藝參數(shù)，最終分析得出三個因子和總黃酮含量的最優(yōu)值分別為，乙醇含量65.00 %，溫度50.09 ℃，超聲頻率89.56 kHz，最大總黃酮含量為7.068 9 %，見表3。

表3 最大總黃酮含量響應(yīng)表

2.3 最大總黃酮含量實驗

以響應(yīng)面設(shè)計實驗得到的理論最優(yōu)工藝參數(shù)為依據(jù)進(jìn)行驗證試驗，設(shè)定乙醇含量65 %，溫度50 ℃，超聲頻率89 kHz，進(jìn)行平行實驗，實驗結(jié)果見表4。

表4 平行實驗結(jié)果

對比表3和表4可得，以響應(yīng)面設(shè)計實驗得到的理論最優(yōu)工藝參數(shù)和總黃酮含量最優(yōu)值與實驗結(jié)果相符，并得到實驗條件下的優(yōu)化工藝參數(shù)：乙醇含量65 %，溫度50 ℃，超聲頻率89 kHz，最大總黃酮含量為6.913 4 %。

3 結(jié)論

以優(yōu)化青錢柳總黃酮化合物提取工藝的研究鮮有報道。前人對青錢柳總黃酮提取工藝主要在乙醇和蒸餾水等單因素方面研究頗多，如：青錢柳中黃酮成分提取工藝的優(yōu)化及微量元素分析[16]，但通過數(shù)學(xué)建模方法進(jìn)行青錢柳中黃酮成分提取工藝的優(yōu)化研究還未見報道。筆者通過數(shù)學(xué)建模的方法進(jìn)行響應(yīng)曲面法動力學(xué)試驗，通過乙醇含量，超聲頻率和溫度對青錢柳總黃酮優(yōu)化提取工藝實驗，研究得到3個因子與總黃酮含量的動力學(xué)方程為：

V=6.31-1.36A-4.75B+0.034C-0.013AB+0.073AC-2.975BC-0.60A2-0.37B2-0.43C2

通過最大總黃酮含量平行實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇含量65 %，溫度50 ℃，超聲頻率89KHz時，總黃酮含量最大，達(dá)6.9134 %，以響應(yīng)面設(shè)計實驗得到的理論最優(yōu)工藝參數(shù)和總黃酮含量最優(yōu)值與實驗結(jié)果相符。