(陜西省微生物研究所,陜西西安 710043)

硒是生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的營養(yǎng)元素,有著“生命元素”之稱。1957年,Schwarz確定硒是人和動物必需的營養(yǎng)元素。1973年,硒被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定是人體必需的微量元素,此后大量的研究表明,硒的營養(yǎng)和毒性劑量范圍較窄,人體食物中硒含量少于0.05 mg/kg就會造成缺硒,大于5 mg/kg又會產(chǎn)生中毒[1]。硒在地球上分布不均勻,中國72%地區(qū)處于缺硒、低硒帶,膳食中硒攝入量的不足嚴(yán)重影響著幾億人口的身體健康[2]。缺硒會引起人類的克山病、大骨節(jié)病、癌癥、糖尿病、心腦血管病、不育癥等疾病,而適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)硒可以防癌、抗腫瘤和抗衰老[3-5]。近年來,隨著人們越來越注重保健和養(yǎng)生,各種富硒產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生,種植戶為提高賣點(diǎn),在種植過程中都噴灑無機(jī)硒(硒酸鈉、亞硒酸鈉)來提高產(chǎn)品中硒的含量。但是無機(jī)硒(硒酸鈉、亞硒酸鈉)毒性大,被常用危險(xiǎn)化學(xué)品的分類及標(biāo)志GB13690-2009列為第六類劇毒物質(zhì),無機(jī)硒的使用嚴(yán)重危害了環(huán)境和人類健康。

生物納米硒是由微生物產(chǎn)生的,尺寸在納米級別的單質(zhì)硒形態(tài)[6],具有更寬的安全劑量范圍,有望成為無機(jī)硒的替代品。根據(jù)急性毒性(LD50)數(shù)據(jù)顯示[7],無機(jī)硒LD50=15 mg/kg,有機(jī)硒LD50=30～40 mg/kg,納米硒LD50=113 mg/kg。迄今,納米硒是已發(fā)現(xiàn)毒性最低的硒形態(tài)[8]。納米硒的產(chǎn)生與細(xì)菌的氧化還原反應(yīng)密切相關(guān)[9],隨著研究的不斷深入,能夠合成納米硒的微生物涵蓋的種屬極其豐富,超過30個(gè)屬,包括大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)[11]、乳酸桿菌(Lactobacillus)[12]等,但相關(guān)硒轉(zhuǎn)化芽孢桿菌的研究相對較少。另外,芽孢桿菌在土壤中的抗逆性存活能力強(qiáng),繁殖快,適合于后期制備納米硒菌肥在土壤中施用。本實(shí)驗(yàn)以從陜西省紫陽縣富硒土壤中篩選到的一株納米硒轉(zhuǎn)化芽孢桿菌為材料,對其進(jìn)行了鑒定和納米硒轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,并初步應(yīng)用在富硒獼猴桃的栽培中,以期為后期微生物納米硒肥的應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Lxz-41 2016年分離自陜西省安康市紫陽縣富硒土,菌株已保存至中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),編號M2016578;酵母粉、酵母膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、正辛醇、無水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、蔗糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;亞硒酸鈉 國藥集團(tuán);IF-A增菌液 美國Biolog公司;Ezup DNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純;斜面活化培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基;硒固體平板培養(yǎng)基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.1%,瓊脂粉1.5%,pH自然;液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化鈉0.5%,pH自然;液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖2%,酵母粉0.5%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.15%,pH自然。

DHZ-D恒溫?fù)u床 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;96Ⅱ超聲細(xì)胞破碎儀 西安比朗生物科技有限公司;722可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;6700F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社;2760 PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI);XRS凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司(Bio-Rad);Biolog自動微生物鑒定儀 美國Biolog公司;MK3酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化與形態(tài)觀察 將保藏的lxz-41菌株接入斜面,30 ℃靜置活化24 h后,將活化好的斜面在硒固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線,通過觀察菌落是否變紅來檢驗(yàn)菌株lxz-41是否具有亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化能力[13]。刮取斜面活化菌落,進(jìn)行2.5%戊二醛固定4 h,磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次,乙醇梯度脫水(分別為30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次,100%乙醇2次,15 min/次),乙酸異戊酯置換乙醇2次(20 min/次),每一步完成后經(jīng)8000 r/min離心5 min。將樣品分別在-20、-40和-80 ℃冷凍12 h,并進(jìn)行-70 ℃真空冷凍干燥24 h后,掃描電鏡觀察菌體形態(tài)[14]。

1.2.2 lxz-41菌株的鑒定 取斜面菌落稀釋至Biolog增菌液IF-A中,控制濁度達(dá)到90%～98%之間,然后加入到GenIII96孔板中,30 ℃靜置恒溫培養(yǎng)24 h,進(jìn)行Biolog生理生化的鑒定。同時(shí),取斜面菌落,采用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行l(wèi)xz-41菌種總DNA的提取,利用通用引物進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增,PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃修復(fù)延伸10 min,4 ℃ 冷卻。PCR產(chǎn)物在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行一代測序,然后將序列進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫的比對,利用MAGE 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[15]。

1.2.3 lxz-41菌株對亞硒酸鈉的耐受性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 耐受性的考察 按照1.2.1方法將菌株活化后,接種于液體種子培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h,待用。分別配制亞硒酸鈉含量為0、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000 mg/L液體培養(yǎng)基,加入到96孔板中,每孔加150 μL,每個(gè)濃度三個(gè)平行,同時(shí)做三塊96孔板作為重復(fù),然后每孔接入5 μL lxz-41種子液,30 ℃靜置培養(yǎng)18 h后,立即測定600 nm吸光值和亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化率,同時(shí)進(jìn)行掃描電鏡,考察菌種lxz-41對亞硒酸鈉的耐受情況。

1.2.3.2 亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化率的測定 將方法1.2.3.1中培養(yǎng)18 h后的96孔板的重復(fù)孔進(jìn)行混合,6000 r/min離心10 min取沉淀,加入無菌水,進(jìn)行超聲破碎(150 W,超聲10 s,間歇5 s,共20次),10000 r/min離心2 min,取沉淀進(jìn)行60 ℃烘干4 h,按照GB 5009.93-2017中電感耦合等離子體質(zhì)譜法進(jìn)行硒含量的測定,并計(jì)算納米硒的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率(%)=(沉淀中硒總量/初始培養(yǎng)基中硒總量)×100

1.2.4 菌株lxz-41對納米硒的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 將1.2.1中活化好的斜面菌種轉(zhuǎn)接于液體種子培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h,即為種子液,并以1%的接種量接入亞硒酸鈉濃度為1500 mg/L待優(yōu)化的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在一定的溫度和搖床轉(zhuǎn)速條件下,以納米硒轉(zhuǎn)化率為指標(biāo),采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對培養(yǎng)基組分與培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 碳源種類及濃度的篩選:固定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除碳源以外的其它組分不變,調(diào)整初始pH為7.0,保持1%接種量,在30 ℃下,150 r/min培養(yǎng)18 h,考察不同碳源種類(蔗糖、葡萄糖、飴糖、可溶性淀粉)對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響,而后在最佳碳源種類下,考察碳源濃度(2%、4%、6%、8%、10%)對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響,從而獲得最佳的碳源種類及濃度。

氮源種類及濃度的篩選:固定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除氮源以外的其它組分不變,調(diào)整初始pH為7.0,保持1%接種量,在30 ℃下,150 r/min培養(yǎng)18 h,以納米硒轉(zhuǎn)化率為指標(biāo),考察無機(jī)氮和有機(jī)氮種類(尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、酵母粉、酵母膏、蛋白胨)對轉(zhuǎn)化納米硒轉(zhuǎn)化率的影響,且在最佳氮源組合下,分別考察了有機(jī)氮濃度(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)和無機(jī)氮源濃度(0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響,從而獲得最佳的氮源種類及濃度。

初始pH的篩選:固定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分不變,調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH分別為5、6、7、8、9、10,在30 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)18 h,考察不同初始pH對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響。

溫度的篩選:固定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分不變,調(diào)整初始pH為7.0,保持1%接種量,在不同培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)下150 r/min搖床培養(yǎng)18 h,考察溫度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響。

轉(zhuǎn)速的篩選:固定液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分不變,調(diào)整初始pH為7.0,保持1%接種量,在轉(zhuǎn)速分別為100、120、140、160、180、200 r/min的搖床中 30 ℃培養(yǎng)18 h,考察不同搖床轉(zhuǎn)速對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,固定最佳的單因子條件,選取對結(jié)果影響顯著的因素進(jìn)行進(jìn)一步的Box-Behnken試驗(yàn),以蔗糖濃度、尿素濃度和培養(yǎng)溫度為變量,納米硒轉(zhuǎn)換率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面進(jìn)行條件優(yōu)化,因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 微生物納米硒肥的應(yīng)用 按照1.2.3制備lxz-41種子培養(yǎng)液,并按照5%的接種量接入最優(yōu)培養(yǎng)基中,進(jìn)行10 L發(fā)酵罐納米硒的合成發(fā)酵,18 h后,6000 r/min離心10 min取沉淀,并加入少量無菌水懸浮,進(jìn)行超聲破碎(150 W,超聲10 s,間歇5 s,共20次)[16]。為方便后期農(nóng)戶使用,超聲后的懸液用水稀釋至硒含量為250 mg/L,即為液體微生物納米硒肥。將實(shí)驗(yàn)制備的微生物納米硒肥在周至農(nóng)家樂果蔬合作社獼猴桃基地進(jìn)行獼猴桃富硒小區(qū)實(shí)驗(yàn),將液體微生物納米硒肥用水稀釋25倍,分別在獼猴桃開花期(5月)和果實(shí)膨大期(7月)進(jìn)行葉面噴灑,10月進(jìn)行人工采摘。每次噴施量為1.5 kg/棵或120 kg/畝。小區(qū)劃分見表2,每個(gè)小區(qū)都是5行3列。待果實(shí)成熟后取樣。進(jìn)行果肉、果皮、葉中硒含量的測定。硒含量測定方法同1.2.3.2進(jìn)行。

表2 陜西周至獼猴桃微生物富硒實(shí)驗(yàn)分區(qū)Table 2 Microorganism selenium-enriched experimentarea of kiwi from Zhouzhi,Shaanxi province

注:3×5代表實(shí)驗(yàn)區(qū)每組地塊所種的獼猴桃的排列為3行5列,共15棵;CK組為未噴灑納米硒樣品;T1組為噴灑與納米硒相同硒含量的亞硒酸鈉樣品;T2組為噴灑納米硒樣品。

取樣方法:對每個(gè)地塊采用蛇形取樣法,共取5個(gè)樣,保證每一行取一次樣。另外,為對比硒在果實(shí)與枝葉中的分布情況,取樣時(shí)要保證每個(gè)獼猴桃的果實(shí)、枝葉來自同一樣本。每個(gè)地塊樣品混合,進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三組重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。單因素實(shí)驗(yàn)采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行繪圖,采用SAS 9.0軟件進(jìn)行單因素顯著性分析(P<0.05)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design Expert 8.0進(jìn)行設(shè)計(jì)和結(jié)果分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 lxz-41菌株形態(tài)及鑒定

圖1a為菌株lxz-41在硒平板上培養(yǎng)24 h后的形態(tài),從圖1a中可以看出,菌株lxz-41能夠在硒平板上生長,并且能夠?qū)單徕c還原成紅色的胞內(nèi)納米硒。圖1b是lxz-41經(jīng)過戊二醛固定凍干后的電鏡照片,可以看出菌體形態(tài)短桿狀,兩端橢圓,并且在培養(yǎng)基上形成褶皺。所以,由此可初步判斷l(xiāng)xz-41可能是能夠合成納米硒的芽孢桿菌。

圖1 菌株lxz-41硒平板與SEM形態(tài)Fig.1 Selenium plate and SEM morphology of strain lxz-41注:a:菌株lxz-41在1000 mg/L亞硒酸鈉平板上的形態(tài);b:菌株lxz-41在SEM下的形態(tài)(×1000)。

以菌株lxz-41總DNA為模板,采用細(xì)菌16S rDNA通用引物5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′ 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進(jìn)行l(wèi)xz-41 16S rDNA擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物見圖2,大小為1500 bp左右的產(chǎn)物,切割目的條帶,并用SK8131純化試劑盒純化后,送樣測序。產(chǎn)物測序后,獲得1404個(gè)堿基,并通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后發(fā)現(xiàn),菌株lxz-41屬于芽孢桿菌屬,并與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)、中川芽孢桿菌(Bacillusnakamurai)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)等序列相似度達(dá)到99%,利用MEGA 5.0 中N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖3a,lxz-41與解淀粉芽孢桿菌的進(jìn)化關(guān)系最為相近。進(jìn)一步用Biolog GenIII細(xì)菌鑒定平板進(jìn)行l(wèi)xz-41的生理生化鑒定,結(jié)果如圖3b顯示,在71種C源中,lxz-41能夠明顯利用葡萄糖、乳糖等32種碳源,對蜜二糖、D-半乳糖等24種碳源呈現(xiàn)半利用狀態(tài),對D-果糖、葡萄糖醛酸等15種碳源完全無法利用。在23種化學(xué)因子中,對pH、氯化鈉濃度、鹽酸胍等13種化學(xué)因子展現(xiàn)較強(qiáng)的敏感性,而對醋竹桃霉素、利福霉素SV、潔霉素等10種化學(xué)藥物不敏感。通過以上生理生化指標(biāo)與Biolog數(shù)據(jù)庫比對,并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果,確定lxz-41為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖2 lxz-41 16srDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of lxz-4116S rDNA amplification products

圖3 lxz-41 系統(tǒng)進(jìn)化樹(a)及Biolog GenIII 平板(b)Fig.3 Phylogenetic tree(a)and biologGenIII result(b)of lxz-41注:圖3b中GenIII 96孔板中碳源及化學(xué)因子種類的分布見Biolog說明書。

2.2 菌株lxz-41對亞硒酸鈉的耐受性

圖4顯示lxz-41對亞硒酸鈉的耐受情況,可以看出隨著亞硒酸鈉濃度的升高,生物量(以O(shè)D600 nm表示)總體呈降低趨勢,說明亞硒酸鈉的加入對菌體的生長造成了一定的影響,相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也逐漸降低。當(dāng)亞硒酸鈉添加濃度為4500 mg/L時(shí),培養(yǎng)18 h后,lxz-41的OD值為0.175,說明菌株lxz-41在液體條件下,仍然能夠在含高濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)基中緩慢生長,高于已報(bào)道的酵母菌[17]、乳酸菌[18]對亞硒酸鈉的耐受能力。在亞硒酸鈉添加濃度為1500 mg/L以下時(shí),對生物量積累的影響不大,轉(zhuǎn)化率也維持在60%左右的水平,在亞硒酸鈉1000 mg/L及以下時(shí)轉(zhuǎn)化率雖然保持在較高水平,但合成的納米硒的總量比較低,由此,結(jié)合納米硒的合成總量,本實(shí)驗(yàn)選取1500 mg/L作為亞硒酸鈉的添加量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖5為菌株lxz-41發(fā)酵合成的納米硒的掃描電鏡,從圖中可以明顯看出納米硒的顆粒形態(tài),粒徑大約在300 nm左右。說明lxz-41能夠通過發(fā)酵合成納米形態(tài)的硒顆粒。

圖4 lxz-41對亞硒酸的耐受濃度Fig.4 Tolerance concentration of lxz-41 to selenite

圖5 lxz-41合成的納米硒掃描電鏡(×10000)Fig.5 Scanning electron microscope ofsynthesized nano-selenium(×10000)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 碳源種類對納米硒轉(zhuǎn)化的影響 圖6對比了四種不同常規(guī)碳源對菌株納米硒轉(zhuǎn)化率的影響?？梢钥闯?蔗糖與葡萄糖為碳源比飴糖和可溶性淀粉為碳源的轉(zhuǎn)化率更高,以蔗糖為碳源時(shí),在1500 mg/L亞硒酸鈉添加量下,納米硒的轉(zhuǎn)化率為74.4%±5.1%,顯示蔗糖相比于葡萄糖明顯更有利于菌株lxz-41在硒環(huán)境中對硒的轉(zhuǎn)化,所以選定蔗糖作為納米硒轉(zhuǎn)化的碳源。圖7考察了不同蔗糖濃度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響?？梢钥闯?隨著蔗糖濃度的提高,納米硒轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢,當(dāng)蔗糖濃度為4%時(shí),納米硒轉(zhuǎn)化率最高為76.1%±2.8%。所以選定4%的蔗糖濃度為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的考察濃度。

圖6 碳源種類對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of carbon source typeson conversion rate of nano-selenium

圖7 蔗糖濃度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of sucrose concentrationon conversion rate of nano-selenium

2.3.2 氮源種類及濃度對納米硒轉(zhuǎn)化的影響 圖8對比了有機(jī)氮、無機(jī)氮不同種類對菌株轉(zhuǎn)化納米硒的影響。結(jié)果顯示,總體來看,有機(jī)氮的納米硒轉(zhuǎn)化率要優(yōu)于無機(jī)氮源的納米硒轉(zhuǎn)化率。在有機(jī)氮種類中酵母粉是最適合的有機(jī)氮源,納米硒轉(zhuǎn)化率極顯著高于其他有機(jī)氮源(P<0.01),無機(jī)氮源中尿素對菌體轉(zhuǎn)化納米硒具有極顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)。所以選取酵母粉作為最佳的有機(jī)氮源,尿素作為最佳的無機(jī)氮源。

圖8 氮源種類對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of nitrogen source specieson conversion rate of nano-selenium

圖9考察了酵母粉的不同濃度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響。從圖9中可以看出,當(dāng)酵母粉濃度在3%以下時(shí),轉(zhuǎn)化率維持在60%以上,且相差不明顯。高于4%后,納米硒的轉(zhuǎn)化率降低,主要原因是因?yàn)檫^高的氮源濃度可能對菌株造成了滲透壓力,調(diào)整期延長,在前18 h的生長率較低,所以造成了納米硒的轉(zhuǎn)化率隨著氮源濃度的增大而降低。當(dāng)酵母粉的濃度達(dá)到6%時(shí),未見菌體生長,納米硒轉(zhuǎn)化率為0。圖10為不同尿素濃度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響,從圖10中可以看出,低濃度的尿素能夠提升納米硒的轉(zhuǎn)化率,且當(dāng)添加濃度為0.1%時(shí),納米硒轉(zhuǎn)化率最高,而后隨著尿素濃度的增大,納米硒轉(zhuǎn)化率逐漸降低,0.1%的尿素添加量效果最好。所以選定1%的酵母粉作為最佳的有機(jī)氮源及濃度,0.1%的尿素作為最佳的無機(jī)氮源及濃度。

圖9 酵母粉濃度為納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of yeast concentrationon conversion rate of nano-selenium

圖10 尿素濃度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effect of urea concentrationon the conversion rate of nano-selenium

2.3.3 不同初始pH對納米硒轉(zhuǎn)化的影響 圖11顯示了培養(yǎng)基不同初始pH下菌株對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響。從圖11中可以看出,在pH5～10范圍內(nèi),隨著pH的升高,轉(zhuǎn)化率逐漸升高,當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí),最大轉(zhuǎn)化率為62.9%±3.4%,但在pH為7、8、9時(shí),菌株納米硒的轉(zhuǎn)化率變化并不明顯。所以,選擇初始pH=7.0作為最佳的培養(yǎng)基初始pH。

圖11 初始pH對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.11 Effect of initial pH on theconversion rate of nano-selenium

2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對納米硒轉(zhuǎn)化的影響 圖12顯示了不同培養(yǎng)溫度對菌體轉(zhuǎn)化納米硒的影響.從圖12中可以看出,隨著培養(yǎng)溫度的升高,納米硒轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,原因可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)溫度的升高,菌株的代謝活性增強(qiáng),轉(zhuǎn)化納米硒的能力也增強(qiáng),40 ℃時(shí),轉(zhuǎn)化率為74.1%±2.1%。但當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí),菌株生長受阻,納米硒的轉(zhuǎn)化率也降低。所以,選擇培養(yǎng)溫度為40 ℃作為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)考察的水平。

圖12 培養(yǎng)溫度對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.12 Effect of culture temperatureon conversion rate of nano-selenium

2.3.5 不同搖床轉(zhuǎn)速對納米硒轉(zhuǎn)化的影響 通常情況下,對好氧微生物來說,高的通氧量有利于好氧微生物的生長和代謝。圖13顯示了不同搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速條件對菌株轉(zhuǎn)化納米硒的影響。隨著轉(zhuǎn)速的提高,培養(yǎng)基中溶氧加大,納米硒的轉(zhuǎn)化率也有所提高,但當(dāng)轉(zhuǎn)速升高到160 r/min時(shí),轉(zhuǎn)化率達(dá)到64.3%±2.5%,而后隨著轉(zhuǎn)速的增大,納米硒轉(zhuǎn)化率變化不大。所以選定搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min作為納米硒轉(zhuǎn)化的最佳搖床轉(zhuǎn)速。

圖13 搖床轉(zhuǎn)速對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.13 Effect of shaking speed on conversionrate of nano-selenium

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.3單因素實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果,以納米硒轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值,選取對菌株影響顯著的因素(蔗糖濃度、尿素濃度、培養(yǎng)溫度)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),應(yīng)用Design Expert 8.0對實(shí)際結(jié)果與預(yù)測值進(jìn)行分析對比,如表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

圖14顯示了變量A、B、C的交互作用響應(yīng)面圖,從圖14中可以看出,響應(yīng)面存在極大值,且靠近中心點(diǎn)附近。AB、AC交互作用的等高線呈橢圓形狀,說明對響應(yīng)值的影響顯著,與方差分析結(jié)果一致。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

圖14 各變量之間的交互作用對納米硒轉(zhuǎn)化率的影響Fig.14 The effect of interaction between variousvariables on the conversion rate of nano-selenium

注:**表示極顯著(P<0.01),*表示顯著(P<0.05)。對變量A、B、C分別求一階偏導(dǎo),得到編碼數(shù)據(jù)A=0.32,B=0.08,C=0.17,對應(yīng)實(shí)際變量參數(shù)A(蔗糖濃度)為4.32%,B(尿素濃度)為0.10%,C(培養(yǎng)溫度)為40.51 ℃,在此條件下的理論Y值(納米硒轉(zhuǎn)化率)為83.6%。鑒于實(shí)驗(yàn)的可操作性,將響應(yīng)面優(yōu)化的因素最佳條件調(diào)整為蔗糖4.5%,尿素濃度0.1%,培養(yǎng)溫度40.5 ℃,其它條件為酵母粉1%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.15%,初始pH為7.0,培養(yǎng)溫度40.5 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min,培養(yǎng)18 h,納米硒轉(zhuǎn)化率為86.8%±4.7%,高于理論預(yù)測值,且相對誤差為3.8%,說明此模型能夠較好地反映實(shí)驗(yàn)的各因素與響應(yīng)值的實(shí)際關(guān)系。

2.5 lxz-41在獼猴桃富硒種植中的應(yīng)用

按照1.2.5制備微生物源納米硒肥,并將其在陜西獼猴桃基地進(jìn)行應(yīng)用,應(yīng)用品種為翠香和華優(yōu)兩個(gè)品種,經(jīng)過生長期兩次噴灑后,果皮、果肉、枝葉中硒的含量見表5。

表5 微生物納米硒對獼猴桃的富硒效果Table 5 Selenium enrichment effect ofmicrobial nano-selenium on kiwifruit

注:“N”表示未檢出硒。

從表4中可以看出,在獼猴桃栽培過程中,添加亞硒酸鈉和納米硒都能提高獼猴桃果實(shí)、枝葉中硒的含量,但微生物源納米硒對獼猴桃的富硒能力要優(yōu)于亞硒酸鈉,且不會造成對土壤的污染。硒在獼猴桃各個(gè)部位的富集順序都是枝葉>果皮>果肉,說明硒元素在枝葉中的富集能力要強(qiáng)于果實(shí)中的富集能力。通過對比文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),獼猴桃果實(shí)的富硒能力要低于稻米[19]、玉米[20]、高于晚秋黃梨[21],不同品種的獼猴桃富硒效果不同,在本次實(shí)驗(yàn)的獼猴桃品種中,翠香品種要稍優(yōu)于華優(yōu)。根據(jù)HB001/T-2013中國富硒食品含量分類標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定水果及其制品中硒含量為0.01～0.050 mg/kg,本次實(shí)驗(yàn)的獼猴桃均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

利用16S rDNA分子鑒定手段和Biolog GenIII平板對實(shí)驗(yàn)室保藏的一株納米硒合成細(xì)菌lxz-41進(jìn)行了鑒定,初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),并通過對亞硒酸鈉的耐受性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌株具有較強(qiáng)的亞硒酸耐受能力,在18 h內(nèi)能夠耐受4500 mg/L的亞硒酸鈉。以納米硒轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)通過單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了菌株lxz-41轉(zhuǎn)化合成納米硒的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件,優(yōu)化后的納米硒轉(zhuǎn)化條件為:蔗糖4.5%,尿素0.1%,酵母粉1%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,初始pH為7.0,培養(yǎng)溫度40.5 ℃,搖床轉(zhuǎn)速160 r/min,在此條件下,納米硒的最高轉(zhuǎn)化率為86.8%±4.7%。將利用lxz-41菌株制備的微生物納米硒用于富硒獼猴桃華優(yōu)和翠香品種的栽培中,經(jīng)檢測獼猴桃果肉中硒含量分別達(dá)到了0.035、0.05 mg/kg,且展現(xiàn)了比無機(jī)硒(亞硒酸鈉)更好的效果,為將來富硒獼猴桃的綠色栽培和其它作物的富硒種植提供參考。