盧燕芳，李 彬，徐兩蒲，蘭芳俊，吳志輝，何清雯

大腸埃希菌是與人類疾病關(guān)系密切的腸道菌之一，可引起許多不同類型的腸外感染，如血流感染、腦膜炎和尿路感染等。而大腸埃希菌ST131克隆株是系統(tǒng)發(fā)育分型B2型中一類具有明確致病性的種群[1]，同時也是腸外致病性大腸埃希菌（ExPEC）感染的主要克隆群。該種群通常具有多種毒力因子，并與氟喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物耐藥密切相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌ST131克隆株與腎盂腎炎高度相關(guān)，尤其是ST131的H30亞克隆株與持續(xù)性或復發(fā)性尿路感染密切相關(guān)[1-3]。本研究旨在分析尿路感染B2-ST131克隆株在本地區(qū)的流行情況和分子生物學特征，同時了解其與B2型非ST131克隆株的毒力和耐藥情況，為今后進一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年8月－2015年8月福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院臨床分離的非重復中段尿培養(yǎng)大腸埃希菌357株?；颊吣虺Ｒ?guī)白細胞數(shù)≥5/HP且尿液培養(yǎng)菌落計數(shù)≥105CFU/mL，均診斷為尿路感染。所有菌株均使用VITEK系統(tǒng)鑒 定。

1.1.2 儀器和試劑 細菌鑒定儀為V.T.K 2-Compact全自動微生物檢定儀（法國生物梅里埃公司），PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司），Universal HoodⅡ凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），脈沖場凝膠電泳儀及GEL DOC2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），PCR相關(guān)試劑（大連寶生物有限公司），DNA Maker、電泳用瓊脂糖、Goodview核酸染料（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司），藥敏紙片（英國OXOID公司）。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分型 采用煮沸法提取357株菌株DNA模板，采用多重PCR擴增系統(tǒng)發(fā)育分型基因，包括ChuA、YjaA、TspE4.C2；PCR引物序列參照文獻 [4]。

1.2.2 大腸埃希菌ST131克隆株篩查 采用PCR擴增針對大腸埃希菌ST131克隆株特異性gyrB、mdh基因和O血清型的分子分型基因（O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O22、 O25、O25b、O75、O83和O157），PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻 [5-7]。根據(jù)Achtman方案，使用7個管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA）對所有非O25b、非O16和非B2群大腸埃希菌ST131克隆株采用多位點序列分型（MLST）驗證是否為大腸埃希菌ST131克隆株。

1.2.3 藥敏試驗 采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的紙片擴散法藥物敏感性試驗[8]。酶抑制劑增強雙紙片擴散法檢測大腸埃希菌中的產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株。根據(jù)CLSI（2017年版）[8]規(guī)定的折點判斷敏感、中介和耐藥。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2.4 耐藥基因的檢測 采用PCR法擴增常見β內(nèi)酰胺酶基因（blaCTX-M、blaTEM和blaSHV）。PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻 [9-12]，陽性擴增產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司（Sanger測序法）測序，測序結(jié)果與GenBank序列進行BLAST比對分 析。

1.2.5 毒力基因的檢測 采用多重PCR擴增15對毒力基因，PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻 [13]。

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用χ2或Fisher確切概率法檢驗進行分析比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株的種系分型及大腸埃希菌ST131克隆株篩查

系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果顯示，357株大腸埃希菌中54株（15.1%）為A型，32株（9.0%）為B1型，162株（45.4%）為B2型，109株（30.5%）為D型。162株B2型大腸埃希菌中，MLST結(jié)果顯示55株（55/162，34.0%）被鑒定為大腸埃希菌ST131克隆株，107株為B2型非大腸埃希菌ST131克隆株。55例尿路感染大腸埃希菌ST131克隆株患者中，門診7例，住院48例。住院病例中復雜性尿路感染15例，非復雜性尿路感染33例。血清型的結(jié)果顯示55株大腸埃希菌ST131克隆株屬于兩種類型，O25b-ST131（36株，65.5%）和O16-ST131（19株，34.5%）。162株B2型大腸埃希菌的臨床信息見表1。

表1 尿標本162株B2型大腸埃希菌中ST131克隆株篩查 結(jié)果和相關(guān)信息Table.Details of the ST131 clone in the 162 strains of phylogenetic group B2 Escherichia coli isolated from urine samples

2.2 藥敏試驗結(jié)果

大腸埃希菌ST131和非ST131克隆株對15種常見抗菌藥物的耐藥率見表2，其中ST131克隆株對頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于非ST131克隆株。ST131克隆株的ESBL檢出率65.5%高于非ST131克隆株的檢出率35.5%（P＜0.05）。未檢出對亞胺培南和厄他培南的耐藥株；對磷霉素和呋喃妥因的耐藥率≤3.6%，對阿米卡星的耐藥率≤9.1%。

表2 尿標本大腸埃希菌ST131和非ST131克隆株對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table.Susceptibility of ST131 and non-ST131 clones E.coli to antimicrobial agents（%）

2.3 耐藥基因擴增結(jié)果

55株大腸埃希菌ST131克隆株中共有48株（87.3%）攜帶β內(nèi)酰胺酶基因。其中TEM-1型23株；CTX-M-1組12株（CTX-M-15型11株、CTXM-123型1株）；CTX-M-9組25株（CTX-M-14型25株）。1株同時攜帶CTX-M-15型和CTX-M-14型β內(nèi)酰胺酶基因，11株攜帶CTX-M型和TEM-1型兩種β內(nèi)酰胺酶基因。未檢出blaSHV、CTX-M-2組、CTX-M-8組和CTX-M-25組基因。見表3。

2.4 毒力基因分布

大腸埃希菌ST131克隆株中毒力基因的檢出率高于20%的有12種，檢出率最高的為fimH（98.2%）、fyuA（96.4%）和iutA（90.9%），而107株B2型非ST131克隆株中，毒力基因fimH（99.1%）、fyuA（91.6%）的流行率最高。毒力基因iutA、kpsMT K5和traT在ST131克隆株的流行率顯著高于B2型非ST131克隆株（P＜0.05）。見表1。

表3 55株大腸埃希菌ST131克隆株中 β內(nèi)酰胺酶基因的分布Table.Prevalence of β-lactamase gene in the 55 E.coli ST131 clones

3 討論

尿路感染是臨床中最常見的細菌感染性疾病之一。大腸埃希菌是引起尿路感染最主要的病原菌，75%單純性尿路感染和65%復雜性尿路感染由大腸埃希菌所致[14]。大腸埃希菌不同系統(tǒng)發(fā)育群在耐藥和致病性方面存在較大差異，文獻報道，ExPEC不同系統(tǒng)發(fā)育群根據(jù)其致病能力從高到低分別為B2型、D型、A型和B1型[1]。本組資料顯示，引起尿路感染的大腸埃希菌以B2型（45.4%）為主，D型（30.5%）次之，與國內(nèi)外報道的相一致[1，15]。董敏等[15]對隨機挑選尿路感染患者尿液分離的55株大腸埃希菌分析發(fā)現(xiàn)，B2型和D型分別占43.6%和41.8%，其攜帶的毒力基因種數(shù)最多且致病能力較強。本地區(qū)尿路感染患者中段尿分離的195株非B2型大腸埃希菌中D型的比例明顯較高。本組資料顯示，大腸埃希菌ST131克隆株在我院尿培養(yǎng)中有一定的流行，但流行率低（15.4%，55/357），遠低于國外文獻報道（27%～30%）[2-3]。推測其原因可能為地域或人口組成差異所致。本組資料顯示O25b-ST131克隆株（65.5%）是臨床尿路感染大腸埃希菌ST131的主要克隆株，O16-ST131克隆株占34.5%。這與國內(nèi)Zhong等[16]2015年關(guān)于O16-ST131 和O25b-ST131克隆株研究報道相一致；但本組資料遠高于國外同行的同類研究報道的結(jié)果[1，17-18]。目前，國內(nèi)關(guān)于大腸埃希菌ST131克隆株的研究主要集中在O25b-ST131克隆株，而對O16-ST131克隆株的研究甚少，綜合以前的研究，本組資料提示除O25b-ST131克隆株外，O16-ST131克隆株可能也是大腸埃希菌ST131克隆株的另一個重要類型，未來的研究應(yīng)更多關(guān)注O16-ST131克隆群[16，19]。

本研究藥敏結(jié)果顯示，69.1% ST131克隆株對環(huán)丙沙星耐藥，65.5%菌株產(chǎn)ESBL，產(chǎn)ESBL的ST131克隆株中，78.9% ST131克隆株對環(huán)丙沙星耐藥。另外，ST131克隆株對頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于非ST131克隆株，與文獻報道的ST131克隆株對頭孢菌素類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率顯著高于其他的ST菌株相符合[20]。大腸埃希菌ST131克隆株對臨床常用抗菌藥物高度耐藥可能與臨床藥物使用方法和習慣有關(guān)，如氟喹諾酮類藥物在臨床上廣泛應(yīng)用于尿路感染的治 療。

大腸埃希菌ST131克隆株是近年來細菌耐藥研究領(lǐng)域非常熱門的一類高耐藥性的克隆株，該克隆株與頭孢菌素類抗生素耐藥密切相關(guān)[1，17]。本研究主要分析大腸埃希菌ST131克隆株對常見β內(nèi)酰胺酶耐藥基因的特征，結(jié)果顯示本組大腸埃希菌ST131克隆株中主要以CTX-M型為主，其中blaCTX-M-14檢出率（45.5%）最高，與國內(nèi)外報道的大腸埃希菌ST131克隆株高blaCTX-M-14檢出率（46%～48.4%）相一致[16，21]，提示blaCTX-M-14可能是該院大腸埃希菌ST131克隆株尿路感染患者對頭孢菌素類藥物耐藥的主要原因。本研究中大腸埃希菌ST131克隆株對氟喹諾酮類藥物耐藥率高達69.1%。文獻報道大腸埃希菌ST131克隆株對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要原因是染色體介導的喹諾酮類耐藥決定區(qū)基因（QRDR區(qū)）的染色體突變，特別是回旋酶gyrA1AB和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的parC1aAB突變密切相關(guān)，大腸埃希菌ST131克隆株還與質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥決定簇aac(6')-Ibcr的存在有關(guān)[22]。關(guān)于本組資料中氟喹諾酮類耐藥菌株的特征有待進一步研 究。

本組資料顯示，大腸埃希菌ST131克隆株中多種毒力基因的檢出率高于非ST131克隆株的，其中iutA、kpsMT K5和traT均有顯著差異。文獻報道某些毒力基因的產(chǎn)物可能與大腸埃希菌ST131克隆株引起腎盂腎炎密切相關(guān)[1]。例如，iutA是編碼細菌鐵離子的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，而kpsMT K5是Capsule synthesis 基因，文獻報道由kpsMT K5編碼的基因具有抗吞噬作用而增強大腸埃希菌ST131克隆株的發(fā)病機制[13]，本組資料顯示，iutA和kpsMT K5的檢出率為90.9%和58.2%。 綜上所述，本組尿路感染的大腸埃希菌中存在強毒力和多重耐藥的ST131克隆株，但其流行率低，主要包括O25b-ST131（65.5%）和O16-ST131（34.5%）兩大類，提示O25b-ST131克隆株是本院尿路感染患者中ST131的主要流行型別。O16-ST131克隆株在毒力基因和耐藥率方面顯著有別于 O25b-ST131克隆株。故在防止O25b-ST131克隆株流行的同時也應(yīng)該密切關(guān)注O16-ST131克隆株的發(fā)展趨勢 。