田建國，王春宇，姜 民，毛鐵鑄*

(1.吉林省輻射環(huán)境監(jiān)督站，吉林 長春130000；2.吉林大學第二醫(yī)院 放療科，吉林 長春130041；3.吉林大學公共衛(wèi)生學院，吉林 長春130021)

自噬是機體對廢用的蛋白和細胞器進行降解，并對一些糖類、蛋白質(zhì)再利用的過程，在細胞穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用[1]。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著促癌或抑癌的雙向作用，在膠質(zhì)瘤的放療或化療過程中，自噬在不同腫瘤分型或治療方案中可能導致促進治療或抵抗治療的不同作用[2]。對腫瘤細胞自噬分子機制的研究和自噬調(diào)控因子的發(fā)掘必將有益于個性化治療方案制定。

miRNA是包含20-25個核苷酸的非編碼內(nèi)源性RNA分子，能夠通過對目標mRNA的降解起到轉錄負調(diào)控的作用，在真核生物細胞中廣泛存在[3]。在多種腫瘤中，miRNA通過調(diào)控細胞自噬通路發(fā)揮作用。miR-17-5p(miRNA-17-5p)是miR-17(miRNA-17)家族的一員，在哺乳動物器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在包括惡性膠質(zhì)瘤[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌等多種腫瘤中存在高表達。miRNA在腫瘤細胞中的異常表達，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的放射敏感性方面發(fā)揮著重要作用[7]。鑒于miR-17-5p在膠質(zhì)瘤放射敏感性及自噬中的調(diào)控作用尚未見報道，本研究旨在分析miR-17-5p在膠質(zhì)瘤細胞放射敏感性中的作用，并初步探討其分子機制，以期為膠質(zhì)瘤的放療增敏治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人膠質(zhì)瘤U251細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素購自美國Hyclone公司；anti-miRNA-17(AmiR-17-5p)反義寡核苷酸和陰性對照反義寡核苷酸購自上海生工公司；lipofectamine TM2000試劑盒購自碧云天生物技術研究所；CCK8試劑盒購自北京天根公司；RT-PCR 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；pGFP-LC3重組質(zhì)粒購自上海生工公司；氯喹(chloroquine，CQ)購自美國Sigma公司；MAPLC3抗體、GAPDH抗體、ATG7抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Santa公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉染U251細胞培養(yǎng)于37℃ 細胞培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。毎天均使用倒置顯微鏡觀察細胞，待細胞生長至80%-90%融合時傳代培養(yǎng)。

AmiR-17-5p反義寡核苷酸和陰性對照反義寡核苷酸購自上海生工公司， AmiR-17-5p 序列為5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’,陰性對照序列為5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。取對數(shù)生長期的U251細胞接種于6孔板中，接入數(shù)量每孔5.0×105個，在37℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。孵育后，按lipofeetamineTM2000說明書進行轉染含目標序列的質(zhì)粒。設置空白對照組(未轉染細胞)、陰性對照組(轉染陰性對照序列的細胞)和AmiR-17組(轉染AmiR-17-5p序列的細胞)。

1.3 照射方法GC3000 Elan輻射器(MDS Nordion,加拿大)，X-射線，電壓180 kV，電流18.0 mA，濾板為0.25 mm Cu和1.0 mm Al，劑量率0.40 Gy · min-1，源皮距60 cm。

1.4 CCK8實驗取對數(shù)生長期的細胞于96-孔板中，接入數(shù)量每孔5.0×103個，在37℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。孵育后，5 Gy X-射線輻射處理細胞，設5個復孔，37℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入20 μl CCK8試劑，避光孵育4 h。使用酶標儀測定在OD450 nm處各孔的吸光值，細胞存活率=給藥組OD值/空白對照組OD值。

1.5 實時定量PCRmiR-17-5p引物由上海生工公司合成，上游引物為5’-CCCACCCAGCCTGGCGCCAGAACTGCACACGTACACTATGTGG-3’，下游引物為5’-CCACATAGTG TACGTGTGCAGTTCTGGCGCCAGGCTGGGTGGG-3’。用RNA分離試劑抽提細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行實時定量PCR反應。實時定量 PCR 擴增條件為：(95℃ 4 min→95℃ 30 s→52℃ 30 s→73℃ 30 s)×40。

1.6 GFP-LC3形態(tài)學分析自噬磷酸鈣共沉淀法轉染構建穩(wěn)定表達的U251細胞 GFP-LC3細胞模型。pGFP-LC3重組質(zhì)粒由上海生工公司合成，取對數(shù)期生長的細胞于6孔板中，接入數(shù)量每孔5.0×105個，在37℃ CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，按lipofeetamineTM2000說明書進行轉染。穩(wěn)定轉染的U251細胞使用脂質(zhì)體轉染陰性對照序列和AmiR-17-5p序列，24 h后給予5 Gy X-射線輻射處理，輻射后20 h，應用倒置熒光顯微鏡觀察細胞自噬情況，并獲取照片。以細胞中有10個以上自噬空泡的細胞為自噬陽性的細胞計數(shù)，分析各組自噬水平。

1.7 western bloting取對數(shù)期生長的細胞于6孔板中，接入數(shù)量每孔5.0×105個，AmiR-17-5p轉染后24 h或5 Gy X-射線照射后8 h，收集細胞，100 μl冰預冷的蛋白裂解液充分裂解細胞，離心收集上清液。使用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，上樣20μg蛋白行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳條帶轉移至硝酸纖維膜，室溫條件下的封閉液中孵育30 min，與一抗室溫孵育60 min，洗膜后與二抗孵育60 min。顯色后的條帶使用Gel-Pro 凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描，使用Quantity One軟件分析光密度值。

2 結果

2.1 放射對膠質(zhì)瘤U251細胞miR-17-5p表達的影響給予U251細胞5 Gy X-射線照射，抽提總RNA，經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-17-5p表達在照射后8 h內(nèi)上調(diào)，而在照射8 h后miR-17-5p表達逐漸回落，其中4 h時U251細胞miR-17-5p是模擬照射組時3.1倍(P=0.001)。U251細胞使用anti-miRNA-17的慢病毒轉染，AmiR-17組經(jīng)模擬照射和5 Gy X-射線照射，4 h后， miR-17-5p表達均明顯降低，顯著低于模擬照射+陰性對照組(P=0.008，P=0.006)；而陰性對照組與空白對照組類似，照射后4 h miR-17-5p表達明顯升高(P=0.001)。

2.2 miR-17-5p增加輻射對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖活性的抑制作用U251細胞經(jīng)過5 Gy X-射線照射后，連續(xù)培養(yǎng)48 h，使用CCK-8法分析細胞增殖能力。以模擬照射+空白對照組細胞存活率為100%，模擬照射+AmiR-17組48 h細胞存活率為87.5%，相對于模擬照射+空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；5 Gy照射+AmiR-17組48 h細胞存活率分別為33.6%，明顯低于5 Gy照射+空白對照組(P=0.037)，且明顯低于模擬照射+空白對照組和模擬照射+ AmiR-17組(P=0.003，P=0.009)；陰性對照組和空白對照組間均沒有明顯差異(P>0.05)。

2.3 AmiR-17-5p在膠質(zhì)瘤U251細胞中增強輻射誘導的自噬為探究miR-17-5p對X-射線誘導膠質(zhì)瘤細胞自噬的影響，本研究構建了穩(wěn)定表達GFP-LC3的U251細胞模型，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，U251細胞本底水平的自噬約為7%，5 Gy照射后，自噬水平升高至35%(P<0.001)。脂質(zhì)體轉染后，陰性對照組和AmiR-17組自噬水平分別為6%和7%，沒有明顯變化(P>0.05)。5 Gy照射后，陰性對照和AmiR-17組自噬水平明顯升高，分別為34%和51%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)。

為進一步驗證miR-17-5p對輻射誘導U251細胞自噬的影響，使用Western blotting方法檢測MAPLC3蛋白水平變化。U251細胞經(jīng)過5 Gy X-射線照射后8 h后提取蛋白，使用Quantity One軟件分析蛋白電泳結果，以陰性對照組LC3II/LC3I值為1。AmiR-17組LC3II表達水平明顯升高(LC3II/ LC3I=1.44)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)。氯喹(chloroquine，CQ)能夠通過溶酶體抑制自噬的進程，導致自噬小體的累積，增加自噬通量評價的準確性。使用加入CQ處理后，陰性對照組LC3II/ LC3I值升高至1.47，AmiR-17組LC3II/ LC3I值升高至1.97，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036),提示AmiR-17組X-射線誘導的U251細胞自噬明顯增強，見圖1。

圖1 miR-17-5p在膠質(zhì)瘤U251細胞中增強輻射誘導的自噬

NC為陰性對照組，CQ為氯喹組

2.4 AmiR-17-5p在膠質(zhì)瘤U251細胞中抑制輻射誘導的ATG7表達下調(diào)為探究miR-17-5p對膠質(zhì)瘤細胞自噬相關蛋白的影響，使用Western blotting方法檢測ATG7蛋白水平變化。U251細胞AmiR-17-5p轉染24 h或5 Gy X-射線照射后8 h后提取蛋白，使用Quantity One軟件分析蛋白電泳結果。AmiR-17-5p轉染后，AmiR-17組ATG7表達水平明顯高于陰性對照組(P=0.010)；5 Gy X-射線照射后，陰性對照組ATG7表達水平降低，但相對于照射前沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，AmiR-17-5p轉染后，AmiR-17組ATG7表達水平明顯高于陰性對照組(P=0.003)見圖2。

圖2 AmiR-17-5p在膠質(zhì)瘤U251細胞中抑制輻射誘導的ATG7表達下調(diào)

mock為模擬照射組， NC為陰性對照組，IR為5 Gy X-射線照射組

3 討論

膠質(zhì)瘤是腦部常見的惡性腫瘤，約占全部腦部惡性腫瘤的40%-50%，其惡性增殖和侵襲行為導致常見放化療耐受，患者中位存活時間僅為14.6個月。放療抗性的產(chǎn)生是膠質(zhì)瘤放療失敗的重要原因，但隨著治療療程的增加，膠質(zhì)瘤放療的臨床療效逐漸降低[8]。膠質(zhì)瘤的放療抗性是影響放療療效的重要因素，當前膠質(zhì)瘤放療抗性產(chǎn)生機制并未得到清晰闡明。

自噬是一種保守的進化過程，細胞通過降解和循環(huán)胞內(nèi)成分維持細胞穩(wěn)態(tài)。自噬在腫瘤中具有雙重功能，自噬能夠作為細胞穩(wěn)態(tài)維護機制發(fā)揮抑癌作用，又能在在環(huán)境應激下維持腫瘤細胞度過不利條件，可能影響到腫瘤的輻射抗性[9]。miR-17-5p是miR-17家族的一員，在哺乳動物器官發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在包括惡性膠質(zhì)瘤[4]、乳腺癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌等多種腫瘤中存在高表達。當前研究表明，miRNA通過與自噬相關基因的調(diào)控作用調(diào)控自噬。miR-17-5p能調(diào)控ATG7、STMN1、RAB5A等多種自噬相關基因，在自噬的不同階段發(fā)揮調(diào)控作用[10]。而miR-17-5p在膠質(zhì)瘤放射敏感性及自噬中的調(diào)控作用尚未見報道。

本研究分析膠質(zhì)瘤U251細胞株X-射線照射后miR-17-5p的表達變化，發(fā)現(xiàn)U251細胞在放射后8 h內(nèi)均表現(xiàn)出明顯的miR-17-5p表達上調(diào)，這提示miR-17-5p在U251細胞放射過程中發(fā)揮作用。Pasi [11]在膠質(zhì)瘤細胞株T98G中敲除了miR-17-5p表達，發(fā)現(xiàn)敲除miR-17-5p表達后T98G細胞體外增殖能力降低，細胞凋亡率升高，小鼠異種移植瘤生長被抑制。為此，本研究采用慢病毒轉染的方法降低了U251細胞miR-17-5p表達，miR-17-5p表達的下調(diào)明顯降低了在放射條件下U251細胞的增殖能力，提示miR-17-5p下調(diào)能夠提高膠質(zhì)瘤U251細胞的輻射敏感性。

電離輻射誘導膠質(zhì)瘤細胞自噬有較多的報道，其機制也得到了不同水平的闡釋。本研究中，經(jīng)過GFP-LC3形態(tài)學檢測確認，5 Gy X-射線照射后U251細胞自噬明顯激活，慢病毒轉染降低miR-17-5p表達后，U251細胞自噬水平進一步提高，提示miR-17-5p下調(diào)提高的輻射敏感性與增強自噬有關。MAPLC3是構成自噬小體重要的蛋白，MAPLC3 II的表達情況能夠用于分析細胞自噬通量；氯喹是自噬晚期階段的抑制劑，阻滯自噬的進程，能夠增加自噬通量評價的準確性[12]。本研究通過western bloting分析了LC3II/ LC3I值，發(fā)現(xiàn)慢病毒轉染降低miR-17-5p表達后，U251細胞自噬通量明顯提高，并且加入氯喹進一步確認了結果，提示miR-17-5p在電離輻射誘導MCF7細胞發(fā)揮著抑制自噬激活的作用。

自噬相關基因7(autophagy related gene 7，ATG7)是重要的自噬相關基因，ATG7在自噬體的形成過程中起到了重要的調(diào)控作用[13]。并且據(jù)新近的報道，miR-17-5p能通過抑制ATG7而抑制電離輻射誘導的肝癌HePG-2細胞的自噬[14]。本研究中，5 Gy X-射線照射后U251細胞ATG表達7略微降低，這與放射導致的細胞死亡有關；慢病毒轉染降低miR-17-5p表達后，U251細胞ATG7明顯提高，這提示miR-17-5p通過抑制ATG7調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤U251細胞自噬過程。

綜上所述，本研究豐富了miR-17-5p-自噬調(diào)控網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p作為膠質(zhì)瘤細胞的自噬調(diào)控miRNA，能夠抑制ATG7的表達并改變膠質(zhì)瘤細胞輻射敏感性。為乳腺癌的臨床靶向治療提供了實驗依據(jù)，但miR-17-5p對靶基因的調(diào)控機制還需更多的工作深入的研究。