朱衛(wèi)星 張敏 甘國興 龍國斌 余文新

[摘要]目的 探討通痹活絡(luò)湯煮散的煎煮工藝。方法 采用高效液相色譜法（HPLC），選用XBridge C18色譜柱，以乙腈-水（49：51）為流動相，檢測波長為330、230 nm，柱溫為室溫25℃測定通痹活絡(luò)湯中蛇床子素和芍藥苷的含量。以總固體和指標(biāo)性成分的含量作為評價指標(biāo)，采用正交試驗篩選其最佳煎煮工藝。通過與傳統(tǒng)飲片藥液質(zhì)量比較，篩選其煮散劑量。結(jié)果 蛇床子素在0.1224～4.0800 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均加樣回收率為101.14%，RSD為1.42%;芍藥苷在0.8194～16.3880 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均加樣回收率為99.55%，RSD為1.79%。最佳煎煮工藝是加12倍水，浸泡5 min，每次煎煮20 min，煎煮1次。通過篩選煮散臨床推薦劑量試驗，選用相當(dāng)于通痹活絡(luò)湯傳統(tǒng)飲片35%的煮散劑量作為臨床推薦劑量。結(jié)論 優(yōu)選的煎煮工藝簡單快速，穩(wěn)定可行，篩選的劑量可為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞]煮散;通痹活絡(luò)湯;煎煮工藝;總固體;蛇床子素;芍藥苷

[中圖分類號] R283? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）9（c）-0007-05

[Abstract] Objective To explore the decoction technology of Tongbi Huoluo Decoction. Methods The content of osthole and paeoniflorin in Tongbi Huoluo Decoction were determined by high performance liquid chromatography （HPLC） with XBridge C18 column， acetonitrile-water （49：51） as mobile phase， detection wavelength at 330， 230 nm and column temperature at room temperature of 25℃. The contents of total solids and index components were used as evaluation indexes， and orthogonal test was used to screen the decoction process. By comparing the quality of decoction with that of traditional decoction pieces， the dosage of decoction was screened. Results Ostholewas in the range of 0.1224-4.0800 μg， with a good linear relationship （r=0.9999）， the average recovery rate was 101.14%， RSD was 1.42%. Paeoniflorin has a good linear relationship in the range of 0.8194-16.3880 μg （r=0.9999）， with an average recovery of 99.55% and RSD of 1.79%. The best decocting process was to add 12 times of water， soak for 5 min， decocting for 20 min each time， and decocting once. Through screening the clinical recommended dose test of decoction， the decoction dose equivalent to 35% of the traditional decoction pieces of Tongbi Huoluo Decoction was selected as the clinical recommended dose. Conclusion The optimized decocting process is simple， rapid， stable and feasible， and the selected dosage can provide guidance for clinical application.

[Key words] Boiling and dispersing; Tongbi Huoluo Decoction; Decocting process; Total solids; Osthole; Paeoniflorin

煮散是湯劑的一種，是將中藥飲片經(jīng)粉碎加工為粗粉后與水共煮去渣取汁而成[1]。通過將藥材粉碎，制成煮散，具有省材、省時的特點[2-4]。通過查閱文獻(xiàn)[5-14]可知，煮散劑具有較高的煎煮效率，不僅能夠節(jié)省藥材，簡化煎煮程序，提高效率，同時還方便患者使用，大大緩解了醫(yī)院中藥代煎等候時間長、中藥飲片費用較高等問題。

通痹活絡(luò)湯是本院康復(fù)科名老中醫(yī)熊同學(xué)主任中醫(yī)師經(jīng)過多年的實踐研究而創(chuàng)立的協(xié)定處方，具有散寒除濕通絡(luò)、補益肝腎的功效，對寒濕型腰痛、腰椎間盤突出癥等病具有獨特效果。該方由中醫(yī)傳統(tǒng)治療痹證經(jīng)典名方之一的獨活寄生湯化裁而成，能夠補肝腎，祛風(fēng)濕，標(biāo)本兼治，主要用于治療痹證日久正虛邪實者[15-17]。本研究通過測定通痹活絡(luò)湯中蛇床子素和芍藥苷的含量，對通痹活絡(luò)煮散劑的煎煮工藝進(jìn)行篩選優(yōu)化，為尋找醫(yī)院煮散代煎工藝新模式提供參考，以便臨床推廣使用。

1儀器與試藥

1.1儀器

Thermo高效液相色譜（HPLC）儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）;四元泵;二極管陣列檢測器;自動進(jìn)樣器;Chromelen色譜工作站;XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;梅特勒萬分之一分析天平;超聲波發(fā)生器（昆山超聲儀器有限公司，型號：KQ-700DE，40 kHz，280 W）。

1.2試藥與試劑

通痹活絡(luò)湯中藥飲片均購自廣東本草醫(yī)藥藥材有限公司，并經(jīng)清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部黃玉明副主任中藥師鑒定均為正品中藥飲片。對照品蛇床子素（批號：110822-201308）、芍藥苷（批號：110736-201438）均購自中國藥品生物制品檢定所，均為分析純試劑。色譜純乙腈（德國Merk公司），屈臣氏蒸餾水。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性? 采用HPLC法，選用XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-水（49：51）為流動相，流速為1.0 ml/min，柱溫為室溫（25℃），蛇床子素的檢測波長為330 nm，芍藥苷的檢測波長為230 nm，進(jìn)樣體積10 μl，芍藥苷理論板數(shù)均>3000，蛇床子素理論板數(shù)均>1000，陰性供試品溶液對主峰沒有干擾，分離度均>1.5。

2.1.2對照品溶液的制備? 精密稱取芍藥苷對照品適量，采用甲醇溶液制成1.6388 mg/ml的對照品溶液儲備液備用。精密稱量蛇床子素對照品適量，加芍藥苷儲備液10 ml制成含有蛇床子素和芍藥苷0.4080、1.6388 mg/ml的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備? 取通痹活絡(luò)湯樣品10 ml，加入硅藻土1 g，置蒸發(fā)皿中蒸干，加甲醇30 ml，振搖，過濾，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml的容量瓶中，加甲醇至刻度處，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4陰性樣品溶液的制備? 按照“2.1.3”中供試品溶液制備方法，制備不含有獨活、白芍的陰性對照溶液。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察? 精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液1、1.5、2、3、4、5 ml，加甲醇溶液稀釋并配置成梯度濃度的混合對照品溶液，采用“2.1.1”項下的方法進(jìn)行測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，C），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y，A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出蛇床子素的回歸方程為：Y=3.65×106X-2.07×104（r=0.9999）;芍藥苷的回歸方程為：A=1.47×106C-1.44×105（r=0.9999）。結(jié)果表明，蛇床子素在0.1224～4.0800 μg、芍藥苷在0.8194～16.3880 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（圖1、2）。

2.2.2精密度試驗? 精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，采用“2.1.1”項下的方法進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積。對照品蛇床子素、芍藥苷的RSD值分別為0.26%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗? 精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1.1”項下方法測定，記錄峰面積，蛇床子素、芍藥苷的RSD值分別1.80%、1.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性試驗? 取通痹活絡(luò)湯煮散各6份，按“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，采用“2.1.1”項下的方法依次測定，計算各成分含量。結(jié)果得出蛇床子素、芍藥苷的RSD值分別為0.27%、0.34%，表明本研究方法的重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率試驗? 稱取已知含量的通痹活絡(luò)湯煮散6份，分別加入對照品適量，按“2.1.3”項下方法制備樣品，采用“2.1.1”項下的方法依次測定，計算平均加樣回收率。結(jié)果提示，蛇床子素的平均加樣回收率為101.14%，RSD值為1.42%，芍藥苷的平均加樣回收率為99.55%，RSD值為1.79%，表明本法具有較好的回收率（表1）。

2.2.6空白試驗? 分別精密吸取“2.1.2”對照品溶液、“2.1.3”供試品溶液、“2.1.4”陰性樣品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，采用“2.1.1”項下的方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，供試品中蛇床子素、芍藥苷色譜峰保留時間與對照品一致，陰性對照溶液在相對應(yīng)對照品溶液相同保留時間處無干擾峰（圖3～7）。

1：芍藥苷

1：芍藥苷

2：蛇床子素

2：蛇床子素

2.3正交試驗

2.3.1因素水平的確定? 選擇加水量、浸泡時間、煎煮時間為主要的3個考察因素，制定每個因素下面的3個水平，選擇蛇床子素、芍藥苷和總固體為評價指標(biāo)，并進(jìn)行綜合加權(quán)評分。以蛇床子素含量（權(quán)重30%）、芍藥苷含量（權(quán)重20%）及總固體量（權(quán)重50%）進(jìn)行綜合評分。按L9（34）進(jìn)行正交試驗，以篩選出通痹活絡(luò)湯煮散的最佳煎煮工藝，因素水平設(shè)計見表2。

2.3.2正交試驗設(shè)計與結(jié)果? 根據(jù)通痹活絡(luò)湯煮散正交試驗結(jié)果，進(jìn)行綜合加權(quán)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為蛇床子素含量（權(quán)重30%）、芍藥苷含量（權(quán)重20%）和總固體（權(quán)重50%）進(jìn)行綜合評分[綜合評分[18]=（X/Xmax×0.3+Y/Ymax×0.2+Z/Zmax×0.5）×100%]。正交分析和直觀分析結(jié)果分別見表3、4。綜合評分后的結(jié)果影響因素大小順序為加水量>煎煮時間>浸泡時間，優(yōu)選工藝為A3B2C1。根據(jù)正交試驗得出優(yōu)選煎煮工藝為A3B2C1，即加12倍量水，浸泡5 min，煎煮20 min。

2.3.3驗證試驗? 為考察所選因素水平中最佳工藝的穩(wěn)定性及可行性，按照最佳工藝條件進(jìn)行3次驗證試驗。試驗結(jié)果顯示，3批通痹活絡(luò)湯煮散中的蛇床子素濃度、芍藥苷濃度和總固體的RSD均<3.00%（表5）。

2.4篩選煮散臨床推薦劑量試驗

通痹活絡(luò)湯傳統(tǒng)飲片處方量為136 g，為確定其煮散臨床推薦劑量，以蛇床子素含量（權(quán)重30%）、芍藥苷含量（權(quán)重20%）和總固體（權(quán)重50%）為評價指標(biāo)，比較不同劑量煮散與傳統(tǒng)飲片湯劑質(zhì)量，從而篩選出煮散臨床推薦劑量。

傳統(tǒng)飲片湯劑制備工藝[19-20]：以原藥材加10倍量水浸30 min，煎煮并保持微沸30 min，趁熱過濾，濾渣加8倍量水煎煮并保持微沸30 min，趁熱過濾，合并濾液，濃縮，冷卻定容至100 ml。煮散制備工藝：按照“2.3.2”項下篩選出的優(yōu)選工藝煎煮，即加12倍量水，浸泡5 min，煎煮20 min，煎煮1次，測定蛇床子素、芍藥苷和總固體含量。

試驗結(jié)果表明，30%劑量煮散時，其與飲片煎煮的分?jǐn)?shù)更接近，但總固體和芍藥苷的濃度含量均低于傳統(tǒng)飲片;35%劑量煮散時，所含芍藥苷與傳統(tǒng)飲片組含量接近，總固體比傳統(tǒng)飲片高約10%，而所含蛇床子素含量約為飲片組的5倍左右。因此，以相當(dāng)于通痹活絡(luò)湯傳統(tǒng)飲片35%的煮散劑量為臨床推薦劑量（表6）。

飲片煎煮劑量為136 g;煮散煎煮1劑量為飲片20%;煮散煎煮2劑量為飲片25%;煮散煎煮3劑量為飲片30%;煮散煎煮4劑量為飲片35%

3討論

通痹活絡(luò)湯有獨活、桑寄生、牛膝、杜仲、當(dāng)歸、白芍、川芎等13味中藥組成，成分較多。隨意選一成分為試驗指標(biāo)，其結(jié)果缺乏說服力，因此，本課題通過前期對通痹活絡(luò)湯煮散處方文獻(xiàn)資料的充分研究，分析該處方中獨活既為君藥又為引經(jīng)藥，有祛風(fēng)除濕，養(yǎng)血和營，活絡(luò)通痹之功，蛇床子素是其主要活性成分。白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，散瘀止痛，是為臣藥，芍藥苷是其主要活性成分。在液相條件摸索過程中，發(fā)現(xiàn)蛇床子素和芍藥苷在甲醇中較穩(wěn)定，無雜質(zhì)干擾，提取效果較好。因此，蛇床子素和芍藥苷被選為通痹活絡(luò)湯的質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究將通痹活絡(luò)湯粉碎成適宜粒度，制成煮散劑，以總固體和指標(biāo)性成分的含量為評價指標(biāo)，采用HPLC測定通痹活絡(luò)湯中蛇床子素和芍藥苷的含量，對其主要影響因素（粉碎度、浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)）進(jìn)行考察。通過正交試驗篩選出其最佳煎煮工藝為加12倍水，浸泡5 min，煎煮20 min，煎煮1次。課題所建立的通痹活絡(luò)湯煮散主要有效成分含量HPLC測定方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可為后期建立通痹活絡(luò)湯煮散制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-02-18? ?本文編輯：孟慶卿）