李秀明，劉罡

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院，上海市 201801；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海市200031

腦梗死是發(fā)病率最高的腦血管疾病，也是世界范圍內(nèi)引起死亡和嚴(yán)重殘疾的主要原因之一[1-2]。在眾多治療策略中，細(xì)胞替代治療讓新生的神經(jīng)細(xì)胞替代腦梗死后死亡的神經(jīng)細(xì)胞，十分具有臨床應(yīng)用前景。自神經(jīng)干細(xì)胞分離成功以來(lái)[3]，經(jīng)過(guò)數(shù)十年發(fā)展，其體外培育、擴(kuò)增和定向分化技術(shù)已經(jīng)非常成熟，能為移植治療提供充足的供體細(xì)胞。

囊腔是腦組織缺血壞死后的終產(chǎn)物。腦梗死急性期大量炎性細(xì)胞和炎性因子浸潤(rùn)[4-5]，這些炎性細(xì)胞和因子在慢性期會(huì)發(fā)生何種變化尚不清楚，是否適宜移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活和分化尚不能確定。此外，腦梗死除造成神經(jīng)組織壞死外，也會(huì)損傷缺血區(qū)的血管結(jié)構(gòu)[6-7]，導(dǎo)致囊腔內(nèi)缺乏微血管，移植細(xì)胞可能無(wú)法獲得足夠養(yǎng)分。本研究觀察囊腔內(nèi)液化學(xué)成分和囊腔壁血供情況，以初步探索囊腔微環(huán)境，分析其是否適宜干細(xì)胞移植，為神經(jīng)干細(xì)胞移植部位選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley 大鼠20 只，2～3 月齡，體質(zhì)量220～260 g，SPF 級(jí)，購(gòu)買于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，并飼養(yǎng)于該中心SPF 環(huán)境中。許可證號(hào)SYXK(滬）2014-0029。室溫(22±1)℃，日光燈6:00～18:00照明模擬明暗周期。每籠飼養(yǎng)大鼠4～5 只，給予充足飼料及飲用水，定期專人更換墊料。

實(shí)驗(yàn)中所涉及的動(dòng)物操作均按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理及福利標(biāo)準(zhǔn)施行，并嚴(yán)格遵守復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)定。

1.2 動(dòng)物模型的制備

采用線栓法制作大鼠永久大腦中動(dòng)脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。

大鼠吸入1.5%異氟烷麻醉，仰臥位固定于操作臺(tái)上，頸部剃毛備皮，安爾碘局部消毒。頸部正中縱行切口，鈍性分離左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎左頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，同時(shí)在其近心端打一個(gè)小活結(jié)，其間斜剪一小切口，將線栓(深圳瑞沃德科技公司)沿切口插入近心端，打緊活結(jié)。斜切口剪斷頸外動(dòng)脈，將線栓近心端下拉，直至與頸內(nèi)動(dòng)脈呈一直線，將線栓沿頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，術(shù)者感到有阻力感，約距左頸總動(dòng)脈分叉處18 mm 處，停止插入。此時(shí)線栓硅膠頭位于大腦中動(dòng)脈處。將頸總動(dòng)脈連同線栓尾部的尼龍線一起結(jié)扎，剪斷多余部分，縫合皮膚。

1.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

大鼠麻醉蘇醒后，立即按Longa 法對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，以評(píng)價(jià)造模是否成功。0 分，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1 分，提鼠尾使其倒立，右側(cè)上肢不能完全向地面伸展；2分，自發(fā)行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，自發(fā)行走時(shí)身體向右側(cè)傾倒；4 分，意識(shí)喪失不能自發(fā)行走；5分，死亡。

1～3分的動(dòng)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MRI

術(shù)后3 d、10 d 和21 d，大鼠前法麻醉，采用MAGNETOM Trio Tim 3.0 T 核磁共振成像儀(德國(guó)SIEMENS 公司)采集圖像，信號(hào)接收使用4 通道動(dòng)物線圈。MRI檢測(cè)序列及參數(shù)如下。T1WI：TR 550 ms，TE 12 ms，層厚2.0 mm，15 層，F(xiàn)OV 60×60 mm，矩陣320×256，分 辨 率0.2×0.2×2.0 mm。T2WI：TR 3330 ms，TE 68 ms，層厚1.0 mm，18 層，F(xiàn)OV 50×50 mm，矩 陣256×256，分 辨 率0.2×0.2×1.0 mm；FLAIR：TR 2000 ms，TE 12 ms，層厚2.0 mm，15層，F(xiàn)OV 60×60 mm，矩陣256×256，分辨率0.2×0.2×2.0 mm。觀察梗死后空腔形成情況，獲取空腔及側(cè)腦室坐標(biāo)。

1.5 囊腔內(nèi)液及腦脊液抽取

術(shù)后23 d，選MRI 掃描確認(rèn)囊腔形成的大鼠，前法麻醉，頭部固定于腦立體定位儀(美國(guó)DAVID KOPF 公司)上，使大鼠上切牙根部低于外耳道連線(耳間線)3 mm，保持大鼠顱頂處于水平面上。剔除顱頂毛發(fā)，消毒皮膚。切開皮膚、皮下組織和顱頂骨膜，少量3%H2O2涂布術(shù)區(qū)，充分止血并顯露前后囟。以前囟為基準(zhǔn)點(diǎn)，根據(jù)MRI獲取的側(cè)腦室和囊腔中心點(diǎn)坐標(biāo)調(diào)整立體定位儀，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑0.5 mm，暴露硬腦膜。鉆孔時(shí)滴加生理鹽水，保持暴露部位濕潤(rùn)。立體定位儀移動(dòng)臂將25 μl 微量進(jìn)樣器緩慢插入囊腔中心，留置2 min 后緩慢抽取囊腔內(nèi)液，留針5 min，退針。同法側(cè)腦室抽取腦脊液。囊腔內(nèi)液和腦脊液分組別混勻，-70 ℃低溫冰箱(美國(guó)HARRISZHIZ公司)冰凍保存。

1.6 囊腔

1.6.1 大體觀察與取材

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物深度麻醉處死，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 ml，后灌注4%多聚甲醛300 ml，取腦，觀察囊腔大體解剖情況。為更好顯示腦膜血管，1 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)心臟灌注。大腦置4%多聚甲醛固定過(guò)夜；10%、20%、30%、30%梯度蔗糖脫水沉底；OCT 包埋劑(日本SAKURA 公司)包埋，冷凍后RM213 冰凍切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)切片，厚20 μm。

1.6.1 HE染色

冰凍切片流水沖洗后蘇木素(碧云天公司)染10 min，酒精性伊紅復(fù)染30 s，95%、95%、100%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6.2 Lectin染色

冰凍切片加10%正常山羊血清(碧云天公司)室溫孵育2 h；異硫氰酸熒光素-葡聚糖(美國(guó)SIGMA 公司)標(biāo)記的兔抗Lectin 一抗(美國(guó)SIGMA 公司，1∶1000)4 ℃孵育48 h；TBS 緩沖溶液漂洗3 次，每次10 min，封片。隨機(jī)選取腦梗死周邊區(qū)及梗死對(duì)側(cè)大腦相對(duì)區(qū)域各3 個(gè)高倍鏡視野，采集圖像并觀察囊腔形態(tài)及周邊組織構(gòu)造。

1.7 質(zhì)譜檢測(cè)

對(duì)混勻的腦脊液和復(fù)融后的囊腔液分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，12%SDS-PAGE 電泳銀染。各樣品中加入適量4% SDS、50 mmol/L Tris.HCl(pH=7.5)充分混勻，加入DTT 使終濃度為100 mmol/L，95 ℃加熱5 min。冷卻后加UA 緩沖液200 μl，轉(zhuǎn)入30 K filter 中，12 000 r/min 離心15 min；再加UA 緩沖液200 μl，12 000 r/min 離心15 min。加50 mmol/L IAA溶液100 μl，室溫避光放置20 min，12 000 r/min 離 心15 min。加50 mmol/L NH4HCO3100 μl，12 000 r/min 離心15 min，重復(fù)2次。加Trypsin 50 μl 37 ℃酶解過(guò)夜。加50 mmol/L NH4HCO3溶液50 μl，12 000 r/min 離心15 min。收集管中酶解產(chǎn)物，冷凍干燥，0.1%甲酸水復(fù)溶。取樣品2 μg行液質(zhì)聯(lián)用Obitrap檢測(cè)。

取酶解產(chǎn)物20 μl，加0.1%甲酸水400 μl 和SCX 6.0 μl，充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清于干凈EP 管中，標(biāo)記為ft；加入pH4 緩沖400 μl 充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置干凈EP 管中，標(biāo)記為pH4；加pH6 緩沖400 μl 充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置干凈EP 管中，標(biāo)記為pH6；最后加入25%氨水、50%乙腈溶液400 μl充分混勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清置EP 管中，標(biāo)記為pH10。不同組分收集液冷凍干燥后，0.1%甲酸水充分溶解。

將各分級(jí)組分轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中，取適量液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。各分級(jí)洗脫梯度2 h，色譜柱為C18 3 μm，120 A，75 μm ID，長(zhǎng)150 mm。QExactive 質(zhì)譜 檢測(cè)，MaxQant進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

將囊腔液與腦脊液質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，篩選差異分子。篩選標(biāo)準(zhǔn)為分子濃度比＞2.0 或＜0.5，倍數(shù)變化最高前10種分子為顯著差異分子。篩選出的差異分子GeneCard檢索，分析其主要功能。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死后囊腔形成

術(shù)后3 d，MRI 示壞死區(qū)組織腫脹，信號(hào)不均勻；10 d 壞死區(qū)囊腔形成，囊腔內(nèi)有T1低信號(hào)、T2高信號(hào)液體信號(hào)；21 d壞死區(qū)囊腔形態(tài)基本穩(wěn)定。見(jiàn)圖1。

2.2 囊腔大體解剖

囊腔由壞死區(qū)周邊正常腦組織與軟腦膜共同構(gòu)成，軟腦膜完整，表面存在血管。見(jiàn)圖2。

2.3 HE染色

囊腔中心無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)；部分囊腔壁由軟腦膜構(gòu)成，腦膜結(jié)構(gòu)完整，其上可見(jiàn)腦膜血管；囊腔中心與腦膜交界處可見(jiàn)大量細(xì)胞聚集。見(jiàn)圖3。

2.4 Lactin染色

囊腔周圍可見(jiàn)血管分布，與對(duì)側(cè)相應(yīng)腦區(qū)相比，未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖4。

2.5 差異分子

圖1 腦梗死后囊腔形成

圖2 囊腔大體解剖

圖3 囊腔周邊HE染色

圖4 囊腔周邊Lactin染色

共篩選出36種差異分子，其中31種上升，5種下降。相對(duì)濃度變化最大的10 種分子見(jiàn)圖5。經(jīng)檢索，其中6 種顯著差異分子對(duì)干細(xì)胞移植具有正面促進(jìn)作用，如抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活等。NCAN(神經(jīng)黏蛋白)是由神經(jīng)元分泌的特異性蛋白質(zhì)，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，可與神經(jīng)元細(xì)胞膜上特異性受體神經(jīng)黏附分子和膠質(zhì)細(xì)胞黏附分子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞連接，影響軸突生長(zhǎng)；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后其表達(dá)增加，并抑制軸突生長(zhǎng)。BCAN(短蛋白聚糖)為神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)分子，在膠質(zhì)增生過(guò)程中表達(dá)增高。PLA2G7(血小板活化因子乙酰水解酶)可明顯減輕血小板活化因子和氧化磷脂的炎癥介質(zhì)效應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激連鎖反應(yīng)，對(duì)血管內(nèi)皮有保護(hù)作用。SPARCL1(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白樣蛋白1)可能抑制腫瘤生成。NELL2(神經(jīng)上皮生長(zhǎng)因子樣蛋白2)可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活及生長(zhǎng)。LGALS3BP(半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白)可促進(jìn)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附，可能刺激抗病毒及腫瘤防御。

未發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的相關(guān)分子，而促進(jìn)向膠質(zhì)增生分化的相關(guān)分子較多，另外一些分子，如神經(jīng)黏蛋白，可能阻礙神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。囊腔微環(huán)境可能主要誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)方向分化。

圖5 囊腔液/腦脊液質(zhì)譜分析結(jié)果(相對(duì)分子倍數(shù)變化)

2.7 質(zhì)譜分析

急性期反應(yīng)信號(hào)通路分析顯示參與急性期反應(yīng)的分子表達(dá)減少，急性期反應(yīng)通路抑制；經(jīng)典通路分析示抗炎及抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加。囊腔內(nèi)液分子重要網(wǎng)絡(luò)分析示，囊腔內(nèi)液分子主要涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、細(xì)胞聚集與組織形成、組織發(fā)育、腫瘤和結(jié)締組織紊亂。見(jiàn)圖6～圖9。

3 討論

腦梗死后缺血區(qū)神經(jīng)元大量死亡，組織結(jié)構(gòu)破壞，可引起相應(yīng)的功能障礙[8-10]；基于神經(jīng)可塑性的功能代償往往并不充分，由缺血性損傷誘發(fā)的內(nèi)源性神經(jīng)再生也極為有限，遠(yuǎn)不能替代缺血所致的神經(jīng)元喪失[11]。因此，腦梗死后功能障礙常持續(xù)存在[1]。

神經(jīng)干細(xì)胞移植可通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)及營(yíng)養(yǎng)、增加突觸可塑性、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞再生等非細(xì)胞替代機(jī)制，減少缺血性損傷程度，促進(jìn)部分神經(jīng)功能恢復(fù)[12-13]。但受腦內(nèi)微環(huán)境影響，由移植細(xì)胞分化而來(lái)的成熟神經(jīng)元數(shù)量低[14]，無(wú)法重建壞死區(qū)組織結(jié)構(gòu)。尋找腦梗死后適宜移植神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，對(duì)提高移植治療效果極為重要。

不同移植部位微環(huán)境特點(diǎn)各有不同[12]。在缺血壞死區(qū)周圍或?qū)?cè)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)移植，移植細(xì)胞向壞死區(qū)遷移受限，且由于腦實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，存在形成假瘤的風(fēng)險(xiǎn)[15]；通過(guò)動(dòng)靜脈系統(tǒng)移植[16-17]，細(xì)胞不易穿過(guò)血腦屏障到達(dá)梗死部位；通過(guò)腦室系統(tǒng)移植，移植細(xì)胞可隨腦脊液播散，或因腦脊液屏障存在，不易在壞死區(qū)大量聚集[18]。

在缺血壞死區(qū)，因急性期組織壞死產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞和壞死因子，不利于細(xì)胞存活，曾被認(rèn)為是移植效率較低的部位。但腦梗死發(fā)生后，受累組織依次經(jīng)歷缺血水腫、炎性滲出、壞死液化等病理變化，最終會(huì)在缺血壞死區(qū)形成囊腔樣結(jié)構(gòu)。囊腔形成的病理過(guò)程始于腦血流中斷后導(dǎo)致的能量代謝障礙，繼而引發(fā)一系列瀑式反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織崩解[4,19-21]。同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被缺血性損傷激活，大量增殖，在損傷部位和缺血半暗帶區(qū)聚集。外周免疫細(xì)胞也可通過(guò)損傷的血腦屏障滲入梗死區(qū)，與小膠質(zhì)細(xì)胞共同介導(dǎo)梗死后免疫反應(yīng)，吞噬清除壞死組織，最終在缺血壞死區(qū)形成囊腔樣結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程可能需要數(shù)周時(shí)間。本研究顯示，腦梗死后3 周，梗死區(qū)即可形成形態(tài)穩(wěn)定的囊腔，其內(nèi)充滿腦脊液樣信號(hào)，提示囊腔內(nèi)主要是液體成分。充裕的液體空間可為移植的神經(jīng)干細(xì)胞提供類似于體外培養(yǎng)的液體環(huán)境，有利于細(xì)胞集落形成。

圖6 囊腔液質(zhì)譜分析(急性期反應(yīng)信號(hào)通路)

腦梗死急性期，小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活(M1 表型)，可通過(guò)產(chǎn)生活性氧、一氧化氮，分泌大量炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化。而在囊腔形成的慢性期，小膠質(zhì)細(xì)胞適度激活(M2表型)，產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)等，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和神經(jīng)母細(xì)胞遷移[5,22]。腦梗死后激活后的免疫細(xì)胞可能發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用[5]。本研究顯示，腦梗死3 周后，與腦脊液相比，囊腔內(nèi)液參與急性炎癥反應(yīng)的蛋白表達(dá)減少，抗炎和抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、黏附聚集和基質(zhì)生成的相關(guān)蛋白表達(dá)增加，有利于移植神經(jīng)干細(xì)胞存活。但應(yīng)當(dāng)注意，盡管囊腔內(nèi)液對(duì)干細(xì)胞移植有促進(jìn)作用，但可能主要誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化，這可能是目前外源性成熟神經(jīng)元數(shù)低下的主要原因。

圖7 囊腔液質(zhì)譜分析結(jié)果(經(jīng)典通路分析)

圖9 重要相關(guān)網(wǎng)絡(luò)2(腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織紊亂)

充足的血供是移植細(xì)胞存活、增殖、分化并產(chǎn)生神經(jīng)功能的前提。本研究顯示，囊腔周邊腦組織和軟腦膜內(nèi)均存在大量血管。原因可能在于腦實(shí)質(zhì)與腦膜分屬兩套供血系統(tǒng)，頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)缺血導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)梗死，而腦膜因其血供來(lái)源于頸外動(dòng)脈系統(tǒng)而常常保持完整，且腦膜血管可能因腦組織缺血而發(fā)生代償性擴(kuò)張[6,23-24]。此外，在腦梗死周邊區(qū)域，缺血本身可誘導(dǎo)新生血管生成[25-26]。腦梗死數(shù)小時(shí)后，梗死周邊膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等即可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VAGF)、一氧化氮合酶等促血管因子和其受體表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管新生，在梗死后數(shù)天即可在梗死灶周邊檢測(cè)到新生血管，此促血管新生作用可持續(xù)數(shù)周[27]。血管新生被認(rèn)為是對(duì)腦梗死的代償性反應(yīng)，有助于減少腦梗死體積，并促進(jìn)腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生和突觸重塑，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。腦梗死后囊腔壁存在基本血液供應(yīng)，可為貼壁的移植細(xì)胞提供養(yǎng)分支持。囊腔的相對(duì)封閉性可能允許對(duì)其進(jìn)行外源性調(diào)控，如利用囊腔置管和液體置換調(diào)控囊腔微環(huán)境?？梢赃M(jìn)一步研究。

本研究從囊腔內(nèi)液分子成分和血供兩方面評(píng)價(jià)了囊腔微環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植的可能影響，但還存在一些局限性。首先因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體型限制，抽取囊腔液體含量較少(每只大鼠25～50 μl)，沒(méi)有進(jìn)行體外干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，不能直接判定囊腔內(nèi)環(huán)境的影響。針對(duì)囊腔內(nèi)缺乏細(xì)胞支架的缺點(diǎn)，可考慮利用聚乳酸-羥基乙酸共聚作為支架，促進(jìn)移植的干細(xì)胞修復(fù)缺損組織結(jié)構(gòu)[28-29]。

綜上所述，腦梗死慢性期形成的囊腔作為一個(gè)相對(duì)封閉的液體空間，具備神經(jīng)干細(xì)胞移植的基本條件，適宜移植細(xì)胞存活。但微環(huán)境中有關(guān)分子成分多促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞分化，還需要外源性手段干預(yù)，使其有利于移植細(xì)胞向神經(jīng)元分化。