曾慈梅 歐宗興 黃鄧高 沈 彬 王 蕾 馬西淼 曹 卉

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院呼吸內(nèi)科，海南?？?570208；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院心胸外科，海南海口 570208；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570208

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性肺部氣流受限的疾病，氣道重塑是COPD 重要的病理生理學(xué)改變[1]。γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）分別是CD4+T 細(xì)胞亞群Th1、Th2 最具代表性的細(xì)胞因子，可采用IFN-γ/IL-4 來(lái)表征Th1/Th2 亞群分布狀態(tài)[2]；同時(shí)，COPD 患者血清中IFN-γ 和IL-4 水平的動(dòng)態(tài)變化與COPD 病程密切相關(guān)[3]。近期的研究[4-5]表明IFN-γ 和IL-4 直接參與了COPD 相關(guān)的氣道和血管重構(gòu)進(jìn)程，但具體的機(jī)制不明。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factors，HIF-1α）和轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子β1（transferring growth factor β1，TGF-β1）在COPD 誘發(fā)的血管重塑過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6-8]。本研究擬評(píng)價(jià)IFN-γ 和IL-4 對(duì)COPD 患者肺成纖維細(xì)胞HIF-1α、TGF-β1 表達(dá)的影響，并結(jié)合患者臨床資料；初步探討IFN-γ 和IL-4 在COPD 患者氣道重塑中的作用，為治療COPD 提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年12 月～2018 年8 月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院?？诟綄籴t(yī)院胸外科因肺癌進(jìn)行手術(shù)切除的正常肺組織（16 例）標(biāo)本和肺癌合并COPD 患者（12 例）的肺組織切片標(biāo)本。術(shù)前均征求患者同意，并記錄患者的年齡、性別、吸煙史和肺功能，并以肺功能為依據(jù)，根據(jù)全球慢性阻塞性肺疾?。℅OLD2017）標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并哮喘、支氣管擴(kuò)張和間質(zhì)性肺疾病等其他肺部疾病史者。

1.2 試劑與方法

重組人IL-4 和IFN-γ 購(gòu)自R&D 公司；HIF-1α和TGF-β1 一抗購(gòu)自Abcam 公司；β-actin 一抗和所有二抗購(gòu)自中杉金橋公司；引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 COPD 患者肺成纖維細(xì)胞與正常肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

取1 cm3COPD 肺活檢組織，無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3 遍，剪碎組織塊成勻漿狀，取約1 mm3左右組織碎塊接種于24 孔板，待組織碎塊貼附后加入DMEM-10%FBS l mL 培養(yǎng)，每3～4 天換液，1～2 周左右可見(jiàn)組織碎塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞爬出，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合成片鋪滿大部分容器底部，0.25%胰蛋白酶0.2 g/L EDTA 消化并轉(zhuǎn)移到25 mL 培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)，1∶2 傳代，取第2～5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1 cm3正常部位肺組織，參照“COPD 患者肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)”的方法進(jìn)行操作。

1.4 qRT-PCR

TRIzolTMReagent（Invitrogene）提取細(xì)胞總RNA，取300 ng 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，采用Takara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑，反應(yīng)體系和時(shí)間參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 稀釋10 倍進(jìn)行qRT-PCR，采用Takara 公司的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑，反應(yīng)體系和時(shí)間參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；使用Applied Biosystem 7500 Fast 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物序列如下：HIF-1α，上引物：5′-GCCAGATCTCGGCGAAGTAA-3′；下引物：5′-CCAGTTAGTTCAAACAGCATCCA-3′TGF-β1；上引物：5′-CTGTCCAACATGATCGTGCG-3′；下引物：5′-TGACACAGAGATCCGCAGTC-3′；β-actin，上引物：5′-AGACCTGTAC-GCCAACACAG-3′；下引物：5′-TTCTGCATCCTGTCGGCAAT-3′。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 相對(duì)變化倍數(shù)。

1.5 Western blot

消化細(xì)胞，500 g/min 收集，加入適量體積RIPA裂解液，冰上裂解1 h，收集上清進(jìn)行BCA 定量，調(diào)整上樣濃度，將蛋白樣品行10% SDS-PAGE 電泳，后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗4℃孵育2 h，ECL 檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)間比較采用t 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 直線相關(guān)法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD 患者及正常肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

光鏡下可見(jiàn)肺組織塊周?chē)谐衫w維細(xì)胞長(zhǎng)出，伴隨上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞混雜，第三代肺成纖維細(xì)胞呈典型紡錘狀形態(tài)，貼壁良好。第四代肺成纖維細(xì)胞視野內(nèi)已幾乎沒(méi)有其他細(xì)胞存在，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。收集細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)波形蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)98%以上。見(jiàn)圖1。

圖1 肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

2.2 HIF-1α 和TGF-β1 在COPD 患者肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況

與正常肺成纖維細(xì)胞比較，COPD 患者肺成纖維細(xì)胞中HIF-1α 的mRNA 平均上調(diào)2.5 倍左右（P ＜0.01）；TGF-β1 的mRNA 平均上調(diào)2.2 倍左右（P ＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 HIF-1α 和TGF-β1 在COPD 患者肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 IL-4 對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞中HIF-1α 和TGF-β1生成的影響

用重組人IL-4（50 ng/mL）刺激正常肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示：IL-4 可引起肺成纖維細(xì)胞HIF-1α、TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)升高（n=5，P ＜0.05），見(jiàn)圖3A～B，且IL-4 的作用時(shí)間與HIF-1α、TGF-β1的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（n=5，P ＜0.05）。見(jiàn)圖3C。

圖3 IL-4 對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞HIF-1α 和TGF-β1生成影響（n=5）

2.4 IFN-γ 對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞HIF-1α 和TGF-β1生成的影響

用重組人IFN-γ（50 ng/mL）刺激正常肺成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示：IFN-γ 可引起肺成纖維細(xì)胞HIF-1α、TGF-β1 的mRNA 和蛋白表達(dá)降低（n=5，P ＜0.05），見(jiàn)圖4A～B，且IFN-γ 的作用時(shí)間與HIF-1α、TGF-β1的蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（n=5，P ＜0.05）。見(jiàn)圖4C。

圖4 IFN-γ 對(duì)正常肺成纖維細(xì)胞HIF-1α 和TGF-β1 生成的影響

3 討論

氣道重塑是COPD 重要的病理生理學(xué)改變[1]。目前已發(fā)現(xiàn)有50 多個(gè)細(xì)胞因子與COPD 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9]。IFN-γ 和IL-4 分別是CD4+T 細(xì)胞亞群Th1、Th2最具代表性的細(xì)胞因子，可采用IFN-γ/IL-4 來(lái)表征Th1/Th2 亞群分布狀態(tài)。Th1/Th2 細(xì)胞直接參與了COPD 的病理進(jìn)程，而COPD 患者的Th1 細(xì)胞亞群向Th2 細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致急性COPD 發(fā)作的重要誘因[10-13]。亦有研究報(bào)道IFN-γ 和IL-4 直接參與COPD誘發(fā)的氣道重塑，但具體機(jī)制不明。

COPD 患者以長(zhǎng)期慢性低氧為特征，在肺血管重塑階段，較低的氧濃度可誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)和活性增加[14]，并可通過(guò)激活其下游分子直接參與COPD 氣道重塑過(guò)程。TGF-β1 是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中重要的調(diào)控因子，可通過(guò)Smad 通路、ERK/MAPK、PI3K/AKT、Wnt 通路等多種途徑促使氣道上皮細(xì)胞損傷、間充質(zhì)細(xì)胞增生，誘發(fā)氣道重塑和氣流受限[15-16]。結(jié)合近期的文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]和IFN-γ、IL-4 在COPD 發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的重要作用，本課題組推測(cè)IFN-γ和IL-4可能會(huì)通過(guò)HIF-1α、TGF-β1 影響氣道重塑過(guò)程。

本研究中，以COPD 患者和正常肺成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，利用重組人IL-4 和IFN-γ 刺激肺成纖維細(xì)胞，模擬COPD 急性期和穩(wěn)定期血清中IL-4/IFN-γ對(duì)肺成纖維細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)：HIF-1α 和TGFβ1 在COPD 患者肺成纖維細(xì)胞中高表達(dá)；IL-4 可促進(jìn)正常肺成纖維細(xì)胞HIF-1α、TGF-β1 的生成，且IL-4 的作用時(shí)間與HIF-1α、TGF-β1 的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)；IFN-γ 可抑制HIF-1α 和TGF-β1 的生成，IFN-γ 的作用時(shí)間與HIF-1α、TGF-β1 的蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示在COPD 患者急性期，血清中高水平的IL-4 和低水平的IFN-γ 發(fā)揮協(xié)同作用，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞產(chǎn)生HIF-1α、TGF-β1，從而促進(jìn)COPD 氣道重塑的發(fā)生。但I(xiàn)L-4/IFN-γ 調(diào)控肺成纖維細(xì)胞HIF-1α/TGF-β1 生成的作用機(jī)制仍不清楚，相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)需要進(jìn)一步闡明。