盛淑婷 魏子白 王云峰 楊長青

長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院消化科(046000)

背景：研究表明腸道菌群、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)在慢性內(nèi)臟痛形成中起有重要作用，但其在腸易激綜合征(IBS)中的作用尚不明確。目的：探討IBS患者腸道黏膜菌群特征與NOX1表達的相關(guān)性。方法：收集2017年7月—2017年12月長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院收治的符合羅馬Ⅳ標準的IBS患者和健康受試者結(jié)腸黏膜標本，利用高通量測序方法檢測腸道黏膜菌群，并分析菌群物種多樣性和豐度。采用免疫組化法測定結(jié)腸黏膜NOX1表達。結(jié)果：IBS組和對照組腸道黏膜菌群以擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門為主。IBS-D組、IBS-U組和對照組之間菌群多樣性相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，IBS組Tissierella豐度明顯增加(H=6.688，P<0.05)，Granulicatella豐度明顯降低(H=6.212，P<0.05)。與對照組和IBS-U組相比，IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度明顯增加(P均<0.05)。與對照組相比，IBS-U組、IBS-D組NOX1表達增加(P<0.01)。腸黏膜NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關(guān)性(r=0.611，P<0.05)，但與Granulicatella豐度無明顯相關(guān)性(r=0.253，P=0.376)。Tissierella、Granulicatella豐度、NOX1表達與IBS嚴重程度無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：IBS患者與健康受試者的腸道黏膜菌群多樣性無明顯變化，部分菌群豐度發(fā)生改變，且不同亞型的菌群豐度變化不同。IBS患者結(jié)腸黏膜NOX1表達上調(diào)，且與Tissierella豐度存在一定的相關(guān)性。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是常見的胃腸道疾病之一，主要癥狀為腹痛，可伴有排便習(xí)慣和糞便性狀的改變[1]。其發(fā)病率高，約占胃腸病門診患者的40%。目前IBS的具體發(fā)病機制仍不清楚，且無有效的治療方法。

活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase, NOX)家族產(chǎn)生的代謝中間產(chǎn)物，主要包括一些小分子物質(zhì)，如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)、次氯酸(CHClO)等。NOX1是NOX家族成員之一，主要表達于腸上皮細胞，參與宿主防御、蛋白質(zhì)的翻譯、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達調(diào)控、細胞分化等過程。NOX1作為一種生物氧化酶，可催化ROS分子如O2-和H2O2的形成[2-3]。研究表明，ROS與疼痛形成關(guān)系緊密。ROS可通過激活GTP酶Rab7介導(dǎo)炎性疼痛過程；通過激活鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ介導(dǎo)神經(jīng)病性疼痛；ROS在癌性骨痛中亦起重要作用，且自由基清除劑對其治療有效[4-6]。但ROS是否可介導(dǎo)IBS患者內(nèi)臟痛的形成，目前尚不明確。

腸道菌群紊亂是IBS發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。動物實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腸上皮細胞可通過NOX1介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，并維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，但在IBS患者中的作用尚不明確。本實驗通過分析IBS不同亞型患者腸黏膜相關(guān)菌群特征、評估IBS癥狀嚴重程度量表并檢測腸黏膜NOX1表達，旨在探討腸道菌群、NOX1表達與IBS之間的相關(guān)性，從而為IBS的治療提供一種新思路。

材料與方法

一、資料來源

收集2017年7月—2017年12月長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院收治的IBS患者，IBS診斷標準[7]：最近3個月內(nèi)每月≥3 d具有反復(fù)發(fā)作的腹痛或腹部不適，且伴有≥2個下列癥狀：①排便后癥狀改善；②排便頻率改變；③糞便性狀改變。在診斷前6個月出現(xiàn)癥狀，近3個月癥狀發(fā)作符合上述診斷標準，且經(jīng)結(jié)腸鏡檢查無異常者。根據(jù)羅馬Ⅳ標準將IBS分為四種亞型：便秘型IBS(IBS-C)、腹瀉型IBS(IBS-D)、混合型IBS(IBS-M)、不定型IBS(IBS-U)。納入標準：①年齡18～65歲；②血尿便常規(guī)檢查無明顯異常；③腹部超聲、結(jié)腸鏡檢查無異常。排除標準：①合并有其他疾??；②有腹部手術(shù)史；③近1個月內(nèi)曾連續(xù)使用抗菌藥物超過3 d；④近2周內(nèi)連續(xù)服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動力藥超過3 d；⑤年齡<18歲或>65歲；⑥處于經(jīng)期、妊娠期或哺乳期婦女。同時以同期性別、年齡、生活環(huán)境等基本情況與IBS患者均匹配的健康體檢者作為對照。本研究方案由長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1. IBS患者癥狀嚴重程度評估：由IBS患者根據(jù)自身情況填寫IBS癥狀嚴重程度量表(IBS-SSS)，完成后由分發(fā)量表者進行檢查并補充完整，然后計算評分。

2. 標本收集和保存：所有入選者于檢查前晚晚餐后禁食，檢查前5 h，將聚乙二醇電解質(zhì)散(購自江西恒康藥業(yè)有限公司)139.12 g溶于2 L溫開水中，每10 min服用250 mL，于2 h內(nèi)服完。在距肛門近端25～35 cm處取黏膜組織2塊，1塊立即保存于-80 ℃液氮中，用于腸道黏膜菌群多樣性和豐度的檢測；另一塊置于90%乙醇中固定，石蠟包埋、保存，用于腸道黏膜NOX1表達的檢測。

3. 菌群測序：利用細菌基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，提取腸道黏膜菌群DNA，具體步驟嚴格按照說明書進行操作。由上海銳翌生物科技有限公司行16S rDNA擴增子測序。

4. 免疫組化法測定腸黏膜NOX1表達：采用兩步法進行免疫組化染色。脫蠟、水化，PBS清洗5 min×3次；3% H2O2封閉10 min；高壓抗原修復(fù)，PBS清洗5 min×3次；胎牛血清封閉10 min；加入一抗(Abcam公司，工作濃度1∶250)4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫30 min，PBS清洗5 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育20 min，PBS清洗5 min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察并攝片。結(jié)果判定：細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒沉淀為細胞陽性。每張切片選取視野清晰的5個不重復(fù)的高倍鏡視野(×400)，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計算積分光密度值并取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

共25例IBS患者納入研究，其中男11例，女14例，平均年齡(47.16±11.01)歲。IBS-U患者10例，其中男2例，女8例，平均年齡(48.40±12.01)歲。IBS-D患者15例，其中男9例，女6例，平均年齡(46.33±10.64)歲。健康對照組13名，其中男6名，女7名，平均年齡(48.62±11.94)歲。IBS患者與健康對照組性別(χ2=0.016，P>0.05)、年齡(t=0.376，P>0.05)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，IBS-D組與IBS-U組性別(χ2=2.442，P>0.05)、年齡(t=-4.52，P>0.05)相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。

二、腸黏膜菌群組成分析

IBS-D組、IBS-U組和對照組腸道黏膜相關(guān)菌群在所有菌屬水平組成見圖1，其中門水平上組成以變形菌門(分別為37.8%、43.2%、46.6%)、厚壁菌門(分別為29.5%、26.4%、29.1%)、擬桿菌門(分別為25.4%、23.7%、16.7%)為主(圖2)。

三、腸黏膜菌群多樣性分析

Alpha多樣性分析顯示，IBS-D組、IBS-U組和對照組Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

四、腸黏膜菌群豐度差異分析

與對照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯降低(H=6.212，P<0.05)，Tissierella豐度明顯升高(H=6.688，P<0.05)。IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度較IBS-U組和對照組明顯增加(P均<0.05)(表2)。

圖1 三組患者所有水平差異物種的Heatmap圖

圖2 腸黏膜菌群在門水平上的相對豐度圖

五、腸黏膜NOX1表達分析

免疫組化結(jié)果顯示，IBS和對照組中均可見NOX1表達陽性著色細胞，IBS組NOX1表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.140 8±0.002 0對0.126 9±0.004 5，P<0.05)，而IBS-D組和IBS-U組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.141 2±0.002 3對0.139 3±0.003 5，P>0.05)(圖3)。

表1 各組腸黏膜菌群Alpha多樣性分析

表2 各組腸黏膜菌群豐度差異分析

**P<0.05

A：IBS組(免疫組化法，×400)；B：對照組(免疫組化法，×400)；C：IBS組、對照組NOX1表達比較；D：IBS-D組、IBS-U組NOX1表達比較

圖3 各組腸黏膜NOX1表達

六、相關(guān)性分析

1. 腸黏膜NOX1表達與菌群的相關(guān)性：Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關(guān)性(r=0.611，P<0.05)，但與Granulicatella豐度無明顯相關(guān)性(r=0.253，P=0.376)。

2. 菌群、NOX1表達與IBS-SSS的相關(guān)性：Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Granulicatella、Tissierella豐度、NOX1表達與IBS-SSS評分均無相關(guān)性(r=-0.153，P=0.459；r=-0.149，P=0.512；r=0.611，P=0.763)。

討 論

有證據(jù)表明，涉及內(nèi)臟痛覺的中樞或外周機制可能受到腸道菌群的影響，如乳酸桿菌和雙歧桿菌屬可減輕應(yīng)激和IBS引起的內(nèi)臟疼痛[8]；大鼠攝入嬰兒雙歧桿菌35624會增加疼痛閾值并減少結(jié)直張擴張(CRD)后的疼痛行為[9]。本實驗發(fā)現(xiàn)，IBS患者腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門為主，IBS組和對照組菌群多樣性相比無明顯差異，IBS亞型間相比亦無明顯差異。與對照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯降低，Tissierella豐度明顯升高。此外，IBS-D組Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacterium豐度較對照組和IBS-U組明顯增加(P均<0.05)。但Ait-Belgnaoui等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，IBS患者腸道差異菌群主要為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、檸檬酸桿菌等。各項研究結(jié)果的不一致可能與研究對象種族、飲食、生活習(xí)慣和地理環(huán)境以及取樣差異、檢測方法等因素有關(guān)。

腹痛是IBS患者的常見癥狀之一。研究表明，腸道菌群可通過其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸來增加血漿色氨酸濃度，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-羥色胺(HT)的傳遞[10]，使下丘腦對內(nèi)臟疼痛的反應(yīng)增強，加重IBS癥狀。目前關(guān)于腸道細菌Tissierella的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗塞小鼠模型中Tissierella數(shù)量明顯升高，但具體機制尚不清楚[11]，可能與IBS組Tissierella豐度升高原因一致。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)IBS-D組Syntrophaceae豐度明顯高于對照組和IBS-U組，而有研究表明Syntrophaceae可分解代謝產(chǎn)生甲烷[12]，這可能與IBS-D患者腹脹、腹部不適有關(guān)。

目前，關(guān)于NOX1的研究多集中于氧化還原、細胞分裂和分化、傷口愈合等，其在穩(wěn)定腸道微生態(tài)中的作用尚不清楚[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，在敲除NOX1基因的小鼠中，鼠沙門桿菌對盲腸細菌濃度和整體組成無明顯影響。但另一項感染檸檬酸桿菌的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，敲除NOX1基因的小鼠盲腸內(nèi)球菌數(shù)量較較正常小鼠減少，疾病狀態(tài)改善[15]。說明腸道微生態(tài)與NOX1表達有關(guān)。

由NOX催化產(chǎn)生的ROS如H2O2為多種細胞內(nèi)信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。ROS調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制是通過氧化特定的活性半胱氨酸殘基而實現(xiàn)的，這些基團位于控制細胞信號通路激活的酶中。因此，含有活性半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)具有氧化還原感受器的功能，并轉(zhuǎn)導(dǎo)由ROS介導(dǎo)的信號。ROS氧化活性半胱氨酸殘基這一性質(zhì)，對于內(nèi)臟疼痛的發(fā)生具有重要意義。

ROS是痛覺過敏的介質(zhì)[16]。研究[4]發(fā)現(xiàn)ROS通過氧化Rab7來介導(dǎo)炎癥性疼痛過程；Kogure等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可通過激活瞬時受體電位陽離子通道A1(transient receptor potential ankyrin 1 cation channel, TRPA1)來介導(dǎo)內(nèi)臟疼痛；乳酸桿菌可刺激小鼠遠端小腸和結(jié)腸中FPR1受體，并通過NOX1迅速產(chǎn)生生理濃度的ROS，并刺激結(jié)腸中ROS依賴性細胞增殖[18]。Matziouridou等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，腸道細菌數(shù)量、組成和移位可能受ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)；Pircalabioru等[15]的研究表明NOX1對腔細菌具有調(diào)節(jié)作用。故推測腸道菌群可通過腸上皮細胞中NOX1表達來介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，從而影響IBS的形成與發(fā)展，但目前關(guān)于此方面的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IBS組腸黏膜上皮細胞中NOX1表達明顯增高(P<0.05)，而IBS-U與IBS-D患者之間無明顯差異(P>0.05)。但由于條件限制，本實驗未能進一步研究IBS腸道差異菌群與NOX1表達間的作用機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者和健康志愿者間腸道菌群在種類數(shù)目上并無明顯差異，但特定菌群的相對豐度發(fā)生改變，且不同亞型的菌群豐度變化不同。結(jié)腸黏膜NOX1表達與Tissierella豐度存在正相關(guān)性，與Granulicatella豐度無明顯相關(guān)性，但現(xiàn)有研究并未發(fā)現(xiàn)差異菌群Granulicatella、Tissierella與NOX1表達間的聯(lián)系，這或許是研究IBS發(fā)生、發(fā)展機制的一個新方向。