李偉偉 閆婭妮 劉 聰 馬 波 殷秀榮

(河北省秦皇島市婦幼保健院1 生殖醫(yī)學(xué)科，2 優(yōu)生遺傳科，秦皇島市 066004，電子郵箱：woshifeng-531@163.com)

世界衛(wèi)生組織報告，全球育齡人群中不孕不育的發(fā)病率高達(dá)10%～15%，其中男方因素占不孕不育所有病因的40%～50%[1]。近年來，特發(fā)性弱精子癥引起的男性不育已成為臨床男性科的疑難雜癥，其發(fā)病機(jī)制成為研究的難題。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是最廣泛的基因多態(tài)性，這些基因的不同可能會導(dǎo)致個體表型的差異、疾病的易感性等。目前，很多學(xué)者專注于男性不育與相關(guān)基因SNP相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)一些基因SNP可能參與細(xì)胞增殖和抗氧化過程，與精子發(fā)生過程相關(guān)，與男性不育存在一定的相關(guān)性[2-3]。精子陽離子通道(cation channel of sperm，CatSper)家族是精子特異性陽離子通道，共有4個成員(CatSper 1～4)[4]。CatSper1定位于鞭毛的主段，在增強(qiáng)精子運(yùn)動、獲能、超活化、受精等方面起重要作用，與弱精子癥的發(fā)生相關(guān)[5-6]。本文旨在通過研究CatSper1的SNP與特發(fā)性弱精子癥的相關(guān)性，進(jìn)一步探索特發(fā)性弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，為治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2016年5月至2018年6月在秦皇島市婦幼保健院男科門診就診的192例特發(fā)性弱精子癥患者作為弱精組。納入標(biāo)準(zhǔn)：前向運(yùn)動精子<32%；均正常性生活1年以上未育，其配偶無生殖相關(guān)疾病。另同期募集288例精液分析正常的已生育男性為對照組。所有研究對象均排除支原體、衣原體等感染，生殖激素和精漿生化檢查均正常。弱精組年齡24～37(30.5±4.7)歲，體重(68.5±16.9)kg；對照組年齡25～36(29.8±6.1)歲，體重(71.3±23.8)kg。兩組研究對象的年齡、體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)秦皇島市婦幼保健院生殖倫理委員會討論通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 精液的獲取及常規(guī)分析 所有研究對象禁欲2～7 d，手淫法采集精液，收集于一次性無菌取精杯內(nèi)，37℃水浴箱溫育。待精液完全液化后按照世界衛(wèi)生組織編寫的《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版標(biāo)準(zhǔn)[7]，利用計算機(jī)輔助精子分析(computer-aided sperm analysis，CASA)系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)分析，并進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析。

1.3 精液CatSper1 rs1893316位點(diǎn)的SNP檢測

1.3.1 引物設(shè)計與合成：登錄GenBank網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查詢CatSper1基因全序列AF407333，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成，由上海索寶生物科技有限公司合成。引物序列如下：CatSper1上游引物為5′-ATTTACAATGAAGGAGTTTGACACA-3,下游引物為5′-GCCAGAGGAATAGTGGGATAAA-3′;內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物為5′-GGTATCGTGGAAGGACTC-3′,下游引物為5′-GTAGAGGCAGGGATGATG -3′。

1.3.2 DNA的提?。簩?00 μL精液與500 μL生理鹽水均勻混合后，4℃下10 000 r/min離心5 min，洗滌沉淀后待用。采用核酸提取試劑盒(上海之江生物科技，批號：P20181201)提取DNA，在沉淀中加入100 μL核酸提取液，震蕩混勻，置于100℃水浴中10 min。4℃下10 000 r/min離心10 min后洗滌沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 SNP的檢測：將所有標(biāo)本的DNA送至上海生物工程公司進(jìn)行飛行時間質(zhì)譜分析，采用Sequenom公司的MassArray生物芯片系統(tǒng)進(jìn)行操作。(1)PCR擴(kuò)增；(2)單堿基延伸；(3)樹脂純化；(4)芯片點(diǎn)樣，啟動MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom公司)芯片上；(5)質(zhì)譜檢測，將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析，檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件(Sequenom公司)分型并輸出結(jié)果。

1.4 精液CatSper1 mRNA的檢測

1.4.1 標(biāo)本處理：將液化后的精液緩慢加入密度梯度液上層，800 r/min離心15 min后洗滌沉淀，棄去上清，將沉淀混勻后輕輕加入裝有0.5 mL培養(yǎng)液的試管底部置培養(yǎng)箱，將試管傾斜45°，靜置30 min，收集上層云霧狀精液用于mRNA及蛋白的檢測。

1.4.2 mRNA的檢測：利用Trizol試劑(Invitrogen公司，批號：10296010)提取總RNA。適量的焦碳酸二乙酯水溶解RNA沉淀，-70℃保存?zhèn)溆?。取適量總RNA稀釋后用分光光度計測定A260/A280，比值均在1.8～2.0，計算濃度后備用。使用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(Fermantas公司，批號：K1622)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，產(chǎn)物于-70℃保存待用。建立25 μL PCR體系，包括2×Taq酶PCR反應(yīng)混合液12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各1.5 μL，模板DNA 2.0 μL，重蒸餾水7.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，降至4℃保溫。擴(kuò)增片段長度為261 bp，凝膠電泳觀察結(jié)果。使用Quantity-One軟件進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參基因GAPDH灰度比值表示目的基因的mRNA相對表達(dá)量。

1.5 精液CatSper1蛋白的檢測 將精液標(biāo)本在室溫下液化30 min，4℃下2 400 r/min離心15 min將精子與精漿分離，棄去上清液并用PBS洗滌3次。將沉淀重新懸浮，調(diào)節(jié)至含有50×106個精子/mL，置于1.5 mL離心管內(nèi)，在4℃的CHAPS緩沖液{20 mmol/L Hepes(pH 7.4)、140 mmol/L氯化鈉、10 mmol/L 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲基]丙磺酸內(nèi)鹽、2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L乙二醇雙四乙酸和完全蛋白酶抑制劑混合物}中勻漿，并在4℃下在熱振蕩器上孵育30 min。然后將裂解物進(jìn)行15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(德國Roche Biosciences公司)上。將膜用5%脫脂奶粉在Tris緩沖鹽水[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)及150 mmol/L氯化鈉]中室溫封閉4 h后與Tris緩沖鹽水稀釋的鼠抗Catsper1抗體(1 ∶500；Abcam公司,批號：ab165120)室溫孵育過夜，用含有0.1%吐溫20的Tris緩沖鹽水洗滌3次后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠的IgG(1 ∶4 000；Abcam公司,批號：ab150077)室溫孵育1 h。顯影儀快速顯影后用Image軟件對圖像進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)對各組基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用單因素Logistic回歸模型進(jìn)行危險因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組精液常規(guī)分析結(jié)果比較 弱精組的前向運(yùn)動精子比例低于對照組(P<0.05)，而兩組的精液濃度及體積、精子正常形態(tài)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組精液常規(guī)分析結(jié)果比較(x±s)

2.2 兩組CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)基因型和基因頻率、遺傳模型比較 CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)的基因型在對照組及弱精組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)，見表2。兩組的CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)基因型及等位基因的分布頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中弱精組TT基因型、CT基因型及T等位基因高于對照組(P<0.05)。見表3。

表2 CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

表3 兩組CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)基因型及等位基因分布的比較[n(%)]

2.3 CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)多態(tài)性與特發(fā)性弱精子癥的相關(guān)性 為了便于分析，將基因型多態(tài)性合并為二分類變量，產(chǎn)生遺傳學(xué)顯性模型、隱性模型和等位基因三種二分類結(jié)果。弱精組中，顯性模型CC/(CT+TT)為92/100例，隱形模型TT/(CT+TT)為21/171例；對照組中，顯性模型CC/(CT+TT)為183/105例，隱形模型TT/(CT+TT)為16/272例。以顯性模型、隱性模型和等位基因?yàn)樽宰兞?均設(shè)置啞變量)，弱精癥的發(fā)生作為因變量，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，攜帶CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)野生型CC是弱精癥發(fā)病的保護(hù)因素，而攜帶突變型TT和等位基因T是弱精癥發(fā)病的危險因素(均P<0.05)。見表4。

表4 CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)多態(tài)性和弱精癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性分析

2.4 兩組不同基因型攜帶者CatSper1 mRNA和蛋白的表達(dá)比較 攜帶TT基因型者中，弱精組的CatSper1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均低于對照組(均P<0.05)。對于攜帶CC和CT基因型者，由于樣本量很大，我們在對照組和弱精組中均隨機(jī)各選取20例進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示CatSper1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表5及圖1。

表5 兩組不同基因型攜帶者CatSper1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

圖1 攜帶不同基因型者精液CatSper1蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

近期有研究表明，精子鞭毛段和頂體主要含有一種特殊的蛋白質(zhì)家族，稱為CatSpers，其可以介導(dǎo)鈣離子的流動，從而調(diào)節(jié)精子活力和過度活躍，在頂體反應(yīng)和獲能中起重要作用[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)。CatSper1敲除的小鼠精子活力較差，精子缺乏快速的前向線性運(yùn)動以及環(huán)磷酸腺苷誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，并且鞭狀運(yùn)動減弱[9]，提示Catsper1與精子活力密切相關(guān)。CatSper1敲除后精子不僅在獲能后仍未見鞭狀運(yùn)動，也失去了穿透透明帶的能力，精子尾部的鈣離子內(nèi)流消失[10]，這表明Catsper不僅可以調(diào)節(jié)精子運(yùn)動，還可以在精子過度活躍和頂體反應(yīng)中發(fā)揮作用[11-12]。此外，臨床研究表明，某些特發(fā)性不育癥患者的精子活力下降與突變引起的Catsper1異常表達(dá)有關(guān)[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)CatSper1在附睪精子中下調(diào)或促進(jìn)弱精子癥的發(fā)生，而生精散治療能夠誘導(dǎo)弱精癥模型大鼠的CatSper1上調(diào)和精子活力的提高。

近年來，已經(jīng)有關(guān)于基因SNP與特發(fā)性弱精子癥相關(guān)性的研究報道。例如，Buldreghini等[15]報告，編碼內(nèi)皮型一氧化氮合成酶中天冬氨酸(Glu298Asp)的T等位基因可能導(dǎo)致精子活力變?nèi)?。然而，很少研究關(guān)注CatSper 的SNP與特發(fā)性弱精子癥之間的關(guān)系。雖然Visser等[16]報告了相關(guān)調(diào)查結(jié)果，他們只提供了序列數(shù)據(jù)，并沒有對較大樣本進(jìn)行相關(guān)分析。因此，我們在Visser等的研究基礎(chǔ)上，使用Sequenom的生物芯片系統(tǒng)，對192例特發(fā)性弱精子癥和288例健康者精液CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)的SNP進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，弱精組TT基因型、CT基因型及T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)；Logistic回歸分析顯示野生型CC是弱精癥發(fā)病的保護(hù)因素，而突變型TT和等位基因T是特發(fā)性弱精癥發(fā)病的危險因素(均P<0.05)。這提示CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)的SNP與弱精子癥的發(fā)生相關(guān)，可能是決定特發(fā)性弱精子癥遺傳易感性的重要因素，其中攜帶突變型TT和等位基因T者發(fā)生特發(fā)性弱精子癥的風(fēng)險更高。

作為同義SNP，rs1893316不改變CatSper1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此，我們推測rs1893316不通過影響氨基酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)致特發(fā)性弱精子癥的發(fā)生。然而，位于CatSper1基因的第一個外顯子中的rs1893316可能通過影響轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致特發(fā)性弱精子癥。因此，我們評估了CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)的SNP與CatSper1 mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示弱精組攜帶TT基因型患者的CatSper1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組攜帶TT基因型者(均P<0.05)；然而，對照組和弱精組之間攜帶CC或CT基因型者的CatSper1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。這提示CatSper1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致攜帶CatSper1基因rs1893316位點(diǎn)TT基因型者更易發(fā)生特發(fā)性弱精子癥。

綜上所述，CatSper1基因的rs1893316多態(tài)性位點(diǎn)與特發(fā)性弱精子癥相關(guān)，攜帶TT基因型者發(fā)生特發(fā)性弱精子癥的風(fēng)險增加，這可能與CatSper1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。