郭萌萌 周延清 段紅英 楊珂 邵露營(yíng)

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007）

地黃是我國(guó)常用中藥材之一，它是玄參科地黃屬多年生草本植物，地黃根作為藥材，具有顯著的藥用效果，是多種中成藥的成分之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。但是，市場(chǎng)上流通的地黃來(lái)源雜亂，品質(zhì)不一，且不同品種間藥用成分差異較大［2］。所以，應(yīng)采取有效的方法鑒定優(yōu)良種質(zhì)的地黃品種。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基因定位克隆，遺傳圖譜構(gòu)建等研究工作的重要工具，目前已廣泛應(yīng)用于作物分子輔助育種及種質(zhì)資源多樣性分析等領(lǐng)域［3-4］，特別是單核苷酸多態(tài)性研究備受關(guān)注。單核苷酸SNP是單個(gè)核苷酸變異而產(chǎn)生的DNA水平上的多態(tài)性。SNP是大多數(shù)基因組中最豐富和穩(wěn)定的遺傳變異形式，多態(tài)性高，數(shù)量多，已成為植物分子輔助育種的主要分子標(biāo)記之一［5］。

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠大規(guī)模的挖掘SNP位點(diǎn)。在植物中的應(yīng)用也十分廣泛，候莉娟等［6］在實(shí)驗(yàn)室已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，挖掘了大量羊草的SNP對(duì)羊草種質(zhì)進(jìn)行分型；周軍永等［7］以李府貢棗不同處理?xiàng)椆麑?shí)的轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)，分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SNP位點(diǎn)的分布，為棗的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化奠定了基礎(chǔ)。Wu等［8］基于銀杏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序收集并驗(yàn)證SNP位點(diǎn)，并分析群體遺傳多樣性，為銀杏的遺傳和基因組研究提供了有用資源。

目前，利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)探討地黃種屬親緣關(guān)系及品種鑒定的研究很少，本研究利用RNA-seq 技術(shù)，對(duì)85-5地黃新鮮塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI中SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中的3個(gè)地黃數(shù)據(jù)比對(duì)，利用Samtools（http：//samtools.sourceforge.net/） 和 VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/）軟件尋找候選SNP。針對(duì)候選SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，選擇能夠擴(kuò)增出單一目的條帶的引物，對(duì)地黃28個(gè)品種間擴(kuò)增，旨為地黃遺傳多樣性分析和品種鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用地黃種質(zhì)收集于河南 4 個(gè)市縣、山東 2 個(gè)區(qū)縣和上海華東師范大學(xué)，包括裂葉地黃（Rehmannia piasezkii）和地黃（Rehmannia glutinosa）這2個(gè)種，共 28 份種質(zhì)。均經(jīng)過(guò)ITS測(cè)序與NCBI比對(duì)，確定為裂葉地黃或地黃種質(zhì)［9］（表1）。

實(shí)驗(yàn)用 Taq Master Mix 由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司合成，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

SNP引物Primer軟件設(shè)計(jì)后于英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 地黃樣本信息

1.2 方法

1.2.1 挖掘SNP位點(diǎn) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期得到的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將其與在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上下載的3個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)分別是由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)上傳的SRR444423.sra 數(shù)據(jù)量為485 M；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)上傳SRR832972.sra 數(shù)據(jù)量2.1 G；藥用植物研究所上傳的SRR832973.sra數(shù)據(jù)量2.1 G。然后通過(guò)格式轉(zhuǎn)換之后，以這3個(gè)組裝好的轉(zhuǎn)錄本為模板序列，將原始序列與其進(jìn)行比對(duì)，利 用 Samtools（http：//samtools.sourceforge.net/） 和VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/） 軟件尋找候選SNP。

1.2.2 設(shè)計(jì)SNP引物 根據(jù)挖掘到的候選SNP位點(diǎn)，利用Primer軟件設(shè)計(jì)引物。在SNP位點(diǎn)的上下游分別設(shè)計(jì)正向引物和反向引物，理想引物的長(zhǎng)度為18-24 bp，Tm值為50-60℃，能保證上下游引物的Tm值一般不超過(guò)2℃；引物序列的GC 含量一般為40%-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC含量不能相差太大。

1.2.3 篩選SNP引物 通過(guò)PCR來(lái)驗(yàn)證SNP引物。設(shè)計(jì)的SNP引物，需要確保能擴(kuò)增出單一、明亮的條帶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包含6 μL的dd H2O，1 μL 的模板 DNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，10 μL Mix。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，適宜退火溫度退火30s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收后測(cè)序。

1.2.4 SNP位點(diǎn)用于28種地黃分型 分別以28種地黃基因組DNA為模板，選用初篩的引物來(lái)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，Sanger法正反向測(cè)序目的序列，檢測(cè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性。根據(jù)SNP位點(diǎn)繪制指紋圖譜。

2 結(jié)果

2.1 地黃SNP位點(diǎn)的挖掘

在地黃轉(zhuǎn)錄組中共有 102075條 Unigene中，檢測(cè)到 35339 個(gè) SNP 位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的發(fā)生頻率為0.51/kb。檢測(cè)出的SNP位點(diǎn)中發(fā)生轉(zhuǎn)換共22718個(gè)（64.28%），顛換共12621個(gè)（35.72%），這6種單核苷酸變異里C/T和A/G的頻率最高，分別達(dá)到31.95%和32.33%，其他4種單核苷酸變異中A/T、A/C、T/G、C/G的頻率分別為9.22%、9.36%、8.80%和8.34%。本次研究極大豐富了地黃的SNP位點(diǎn)信息（表2）。

2.2 SNP引物的設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)SNP挖掘結(jié)果，用Primer 5設(shè)計(jì)了39對(duì)引物，包含了54個(gè)候選SNP位點(diǎn)。對(duì)設(shè)計(jì)的39對(duì)SNP引物，以地黃85-5基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從中挑選出了28對(duì)符合預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度、擴(kuò)增效果清晰單一的SNP引物對(duì)（圖1），用以進(jìn)行后續(xù)分型實(shí)驗(yàn)。

表2 地黃轉(zhuǎn)錄組SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

圖1 引物特異性篩選部分結(jié)果

2.3 地黃SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

為開(kāi)發(fā)多態(tài)性地黃SNP引物，我們用2.2實(shí)驗(yàn)篩選出的28對(duì)特異性引物對(duì)28種地黃種質(zhì)進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)（圖2）。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段，切膠純化回收后用Sanger法直接測(cè)序。在28對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，能夠直接測(cè)序成功并且SNP位點(diǎn)在不同地黃種質(zhì)間不同的僅有7對(duì)（表3）。經(jīng)過(guò)DNAMAN序列比對(duì)軟件比對(duì)后，可以直觀的看出不同地黃種質(zhì)間的SNP位點(diǎn)變化，位點(diǎn)SNP1的比對(duì)圖如圖2所示。經(jīng)測(cè)序后統(tǒng)計(jì)7對(duì)引物所包含的8個(gè)SNP位點(diǎn)在28種地黃種質(zhì)間的檢測(cè)結(jié)果，如表4所示。

2.4 基于SNP位點(diǎn)指紋圖譜繪制

通過(guò)對(duì)28份地黃的8個(gè)SNP位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)可以將地黃17個(gè)種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。利用這8個(gè)SNP位點(diǎn)繪制17份地黃種質(zhì)的指紋圖譜，如圖3所示，不同引物對(duì)的分型結(jié)果用不同的顏色區(qū)分；同一引物對(duì)的分型結(jié)果用數(shù)據(jù)條長(zhǎng)短區(qū)分，數(shù)據(jù)條長(zhǎng)度相同的種質(zhì)，基因型一致，數(shù)據(jù)條長(zhǎng)度不同的種質(zhì)，表明在基因分型時(shí)被分到不同的組。如DH2和DH3兩份地黃種質(zhì)僅在SNP3位點(diǎn)存在差異，其余的SNP位點(diǎn)均無(wú)差異，這表明兩份種質(zhì)的差異較??；而DH6和DH17則是除了在SNP7變異位點(diǎn)處相同，其余的6個(gè)SNP位點(diǎn)均存在差異，表明它們差異較大。

圖2 引物S10在28份地黃材料中擴(kuò)增電泳圖

表37對(duì)多態(tài)性SNP引物

3 討論

目前，應(yīng)用于地黃的分子標(biāo)記主要有RAPD、ISSR［10］、ITS［9］、SSR［11-12］和 SCoT［1］等。但這些分子標(biāo)記各有不足［13］，如技術(shù)難度高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，對(duì)PCR體系要求高等，限制了這些技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。SNP分子標(biāo)記是一種特異性強(qiáng)的遺傳標(biāo)記，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及SNP標(biāo)記的檢測(cè)成本的逐漸下降，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)挖掘SNP位點(diǎn)，會(huì)使得SNP分子標(biāo)記技術(shù)越來(lái)越高效。對(duì)于多倍體或沒(méi)有參考基因組的物種來(lái)說(shuō)，利用新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可大量鑒定SNP［6］。近年也被成功地應(yīng)用于植物的基因分型、品種鑒定、新品種選育等研究中，Jiang［14］利用開(kāi)發(fā)的14個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)30個(gè)柑橘品種進(jìn)行基因分型，區(qū)分了品種間的親緣關(guān)系；李志遠(yuǎn)等［15］在甘藍(lán)中篩選出50個(gè)核心SNP標(biāo)記用于構(gòu)建59個(gè)甘藍(lán)品種的指紋圖譜，能有效鑒定品種的特異性和真實(shí)性；Distefano 等［16］開(kāi)發(fā)出了21個(gè)柑橘SNP標(biāo)記，并對(duì)18個(gè)柑橘品種進(jìn)行遺傳多樣性分析；吳澎等［17］在小麥中可利用SNP標(biāo)記技術(shù)和基因工程技術(shù)相結(jié)合，將多個(gè)優(yōu)質(zhì)感官性狀基因聚合到一個(gè)小麥新品種上；Ferguson等［18］利用53個(gè)木薯品種對(duì)候選SNP位點(diǎn)的驗(yàn)證，篩選出1190個(gè)穩(wěn)定且具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記，用于對(duì)木薯的多樣性評(píng)估和地理起源分析。

目前，常用于SNP分析的有等位基因特異性PCR法［19］、高分辨率溶解曲線分析［20］、DNA芯片法［21］和直接測(cè)序分型法等。由于AS-PCR法對(duì)PCR體系要求嚴(yán)格，HRMA法需要使用專門的設(shè)備，DNA芯片法需要大量合成特異性探針，都不是最優(yōu)的SNP分型法?；赟anger測(cè)序法的SNP分型，它的測(cè)序準(zhǔn)確度高，不僅能夠發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)不同個(gè)體間存在的所有堿基變異，同時(shí)還可以明確各個(gè)的位置及變異類型，是實(shí)驗(yàn)室常用的SNP分型方法。

表428份地黃材料在8個(gè)SNP位點(diǎn)的堿基信息

但是，到目前為止，還未見(jiàn)使用SNP分子標(biāo)記對(duì)地黃種質(zhì)進(jìn)行研究。SNP分子標(biāo)記因其在基因組中數(shù)量最多、分布最廣及具有雙等位基因等特性，正好可以打破地黃品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種間遺傳分化不明顯［22］這種局限性，SNP標(biāo)記將在新品種的特異性、真實(shí)性鑒定方面有更多應(yīng)用。為此，本研究利用首次使用SNP分子標(biāo)記分析28種地黃的遺傳多樣性，豐富地黃分子標(biāo)記技術(shù)，為區(qū)分地黃種質(zhì)提供有力的分子標(biāo)記技術(shù)。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組挖掘SNP位點(diǎn)，豐富了地黃基因組SNP變異信息，在Unihene中共發(fā)現(xiàn)3339個(gè)SNP位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換類型發(fā)生頻率顯著高于顛換類型，轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率約為顛換的兩倍，這與其他植物轉(zhuǎn)錄組SNP變異類型的比例相似［23-24］。轉(zhuǎn)換類型中A/G（32.33%）和C/T（31.95%）的發(fā)生頻率最高，顛換類型中A/T最高為9.22%。地黃轉(zhuǎn)錄組中SNP位點(diǎn)非常豐富，可為地黃遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定與品種區(qū)分等方面提供豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息。根據(jù)SNP候選位點(diǎn)設(shè)計(jì)的39對(duì)引物中，以地黃85-5基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出28對(duì)擴(kuò)增條帶單一、產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期的引物，引物特異性篩選率為72%，成功率較高。但是篩選出的候選SNP位點(diǎn)驗(yàn)證成功率并不是很高，僅有7對(duì)引物所包含的8個(gè)SNP位點(diǎn)在28種地黃種質(zhì)中有差異。這可能是由于在轉(zhuǎn)錄組挖掘SNP位點(diǎn)時(shí)，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)分析時(shí)造成的SNP位點(diǎn)的假陽(yáng)性的原因［25-26］。使用28對(duì)引物在28種地黃中進(jìn)行分型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果僅有7對(duì)引物所包含的8個(gè)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性，根據(jù)8個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)建紋圖譜，可以直觀的區(qū)分17種地黃種質(zhì)。根據(jù)指紋圖譜可以看出8個(gè)SNP位點(diǎn)可以將裂葉地黃從其余27種地黃種質(zhì)中區(qū)分出來(lái)，表明篩選出SNP位點(diǎn)可以用于地黃的種間區(qū)分。其余的鑒別出來(lái)的16種地黃種質(zhì)都屬于地黃種，表明8個(gè)SNP位點(diǎn)也可用于地黃的種間區(qū)分。

在地黃其他分子標(biāo)記的研究中，張進(jìn)忠等［27］篩選出的17條RAPD引物在10個(gè)地黃品種都可以擴(kuò)增出各自的多態(tài)性條帶，檢測(cè)10個(gè)地黃品種的種質(zhì)遺傳多樣性；周延清［10］篩選出17條RAPD引物和10條ISSR引物用于對(duì)10個(gè)地黃品種的種質(zhì)遺傳多樣性分析，并且篩選出能夠鑒別10個(gè)地黃樣品的RAPD引物兩個(gè)與ISSR引物一個(gè)；郭冠瑛［2］利用地黃轉(zhuǎn)錄組信息，設(shè)計(jì)了 320 對(duì) EST-SSR引物，213對(duì)引物在地黃85-5的基因組擴(kuò)增出了產(chǎn)物，只有 80對(duì)引物在 36 份地黃種質(zhì)中具有多態(tài)性。楊珂等［1］利用5個(gè)SCoT引物構(gòu)建30份地黃種質(zhì)的指紋圖譜，結(jié)果能區(qū)分開(kāi)7個(gè)地黃常見(jiàn)栽培品種。我們基于8個(gè)SNP位點(diǎn)繪制指紋圖譜，可以將28個(gè)地黃種質(zhì)區(qū)分出17種，區(qū)分力度稍弱，這有待于繼續(xù)大量開(kāi)發(fā)SNP位點(diǎn)，為地黃品種鑒定提供更有效的技術(shù)。

本研究以鑒定地黃品種，豐富地黃分子標(biāo)記為目的，采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法進(jìn)行地黃的SNP分型，結(jié)果表明有7對(duì)引物，包含8個(gè)SNP位點(diǎn)能在17份地黃材料中表現(xiàn)出多態(tài)性，并根據(jù)8個(gè)SNP位點(diǎn)的差異構(gòu)建了指紋圖譜，對(duì)地黃品種的遺傳多樣性做了補(bǔ)充，為鑒定地黃品種開(kāi)發(fā)了有效的分子標(biāo)記，為大量開(kāi)發(fā)地黃SNP標(biāo)記來(lái)全面評(píng)估地黃遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)，使用SNP分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)準(zhǔn)確鑒定地黃品種對(duì)種質(zhì)管理和育種也有重要意義。

圖3 利用8個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)地黃17個(gè)種質(zhì)繪制的指紋圖譜

4 結(jié)論

通過(guò)地黃轉(zhuǎn)錄組挖掘SNP位點(diǎn)，在28份地黃種質(zhì)中篩序多態(tài)性SNP位點(diǎn)，利用8的SNP位點(diǎn)能夠鑒定17種不同的地黃種質(zhì)。