刁小琴，關(guān)文婷，關(guān)海寧，張 瑛，云 波，黎 亞

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

冷凍是迄今為止一種應(yīng)用廣泛、價(jià)格低廉、效果較好的保藏肉的方法；解凍是凍結(jié)肉中的冰晶融化，并被肉重新吸收恢復(fù)到凍結(jié)前新鮮狀態(tài)的過(guò)程[1]。通常肉經(jīng)凍結(jié)、解凍處理后會(huì)出現(xiàn)色澤和質(zhì)地變差、汁液流失、保水性降低等問(wèn)題[2]，因此，凍結(jié)與解凍方式的選擇對(duì)肉的品質(zhì)起著非常重要的作用。肌原纖維蛋白是豬肌肉的重要組成成分之一，具有持水性、乳化性以及凝膠性等多重功能特性。蛋白質(zhì)的凝膠特性在肉制品加工中決定著成品的質(zhì)構(gòu)和感官。SAELEAW 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，隨著凍結(jié)時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)類肌原纖維蛋白形成的凝膠強(qiáng)度變小。任麗娜[4]研究冷凍對(duì)白鰱魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍會(huì)減弱凝膠的形成能力。劉富康[5]研究發(fā)現(xiàn)，微波解凍的魚(yú)糜，其凝膠持水力和凝膠形成能力較差。

本試驗(yàn)將豬肉采用- 18，- 50 ℃凍結(jié)，然后分別以微波、空氣及4 ℃解凍方式對(duì)其進(jìn)行解凍，研究不同凍結(jié)與解凍方式對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性及凝膠形成過(guò)程中蛋白質(zhì)分子間作用力的影響，旨在為凝膠的形成機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為獲得維持豬肉凝膠較好品質(zhì)以及為實(shí)際肉品的凍結(jié)和解凍提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供試材料為豬背最長(zhǎng)肌，購(gòu)自綏化市大潤(rùn)發(fā)超市。購(gòu)買后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除豬肉表面脂肪和結(jié)締組織，切分為100 g 左右的肉塊，進(jìn)行冷凍處理。

1.1.2 試劑 牛血清蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；乙二醇雙（2- 氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）（北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；哌嗪- 1，4- 二乙磺酸（PIPE，上海麥克林生化科技有限公司）；β-巰基乙醇（分析純，上海建鑫化工試劑廠）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅、氯化鎂、氯化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TH- 120- 150- WA 超低溫冰箱（北京天地精儀科技有限公司）；GL- 16G- Ⅱ高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DS- 1 高速組織搗碎機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；ZE- 6000 色差計(jì)（日本色電工業(yè)株式會(huì)社）；TA- XT plus 型質(zhì)構(gòu)分析儀（英國(guó)Stable Micro System 公司）；752 紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的凍結(jié) 切分好的肉塊隨機(jī)分成2 組，每組3 塊，分別置于- 18，- 50 ℃條件下凍結(jié)，凍藏3 d 后進(jìn)行解凍處理；同時(shí)以新鮮肉樣不進(jìn)行處理為對(duì)照組（CK）。

1.3.2 樣品的解凍 2 個(gè)凍結(jié)組分別采用微波解凍、空氣解凍（室溫20 ℃）和4 ℃條件下解凍。

1.3.2.1 空氣解凍 將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，以空氣為介質(zhì)進(jìn)行自然解凍，肉塊中心溫度達(dá)到4 ℃即可。

1.3.2.2 微波解凍 將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于微波爐中，啟動(dòng)質(zhì)量解凍按鈕，解凍到肉塊中心溫度達(dá)到4 ℃即可。

1.3.2.3 4 ℃解凍 將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于4 ℃冰箱進(jìn)行解凍，肉塊中心溫度達(dá)到4 ℃即可。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取 參照XIA 等[6]的方法從不同處理組中提取肌原纖維蛋白，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定[7]。

1.3.4 凝膠的制備 將不同處理得到的肌原纖維蛋白用50 mmol/L PIPES（含0.6 mol/L NaCl，pH 值6.0）配成40 mg/mL 的溶液，將溶解的蛋白溶液分裝于凝膠瓶中于4 ℃條件下平衡過(guò)夜，次日取出室溫平衡30 min，放入72 ℃水浴加熱10 min 后立即取出冰浴冷卻，用于凝膠強(qiáng)度、白度、持水性以及凝膠在形成過(guò)程中蛋白質(zhì)分子間作用力的測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 參考秦傳軍等[8]的方法，稍作改動(dòng)。采用質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行測(cè)定，采用P/0.5 柱形探頭（直徑12 mm），將凝膠置于探頭正下方，前進(jìn)速度為1 mm/s，穿刺距離為10.0 mm，用穿透力來(lái)表示凝膠強(qiáng)度。

1.4.2 凝膠白度的測(cè)定 參考于建行[9]的方法，稍作改動(dòng)。將樣品在室溫平衡一段時(shí)間，用色差計(jì)測(cè)定，要求凝膠填滿整個(gè)樣品池，樣品池底部置于載物臺(tái)上，每個(gè)樣品順著一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)3 次，分別測(cè)定，最后取其平均值。

式中，L*值代表亮度，a*值代表紅度，b*值代表黃度。

1.4.3 凝膠持水性的測(cè)定 參考唐曉婷等[10]的方法，稍作改動(dòng)。分別稱取不同處理的肌原纖維蛋白凝膠樣品各5g，放入離心管中，4℃條件下6000r/min離心15 min，倒出上層液體，用濾紙吸干凝膠表面殘余的水分。

式中，M1為離心前凝膠的質(zhì)量（g）；M2為離心后凝膠的質(zhì)量（g）。

1.4.4 凝膠在形成過(guò)程中蛋白質(zhì)分子作用力的測(cè)定 將1 g 凝膠分別加入3 種不同的蛋白變性劑中，混合后于13 500 r/min 均質(zhì)20 s；為了達(dá)到最大的溶解度，將其放在80 ℃的水浴鍋中加熱1 h，4 000×g 離心15 min，吸取上清液，通過(guò)雙縮脲法測(cè)定蛋白含量。其中，蛋白溶解度即為上清液中溶解出的蛋白含量占凝膠中總蛋白的百分比。蛋白變性劑分別為含8 mol/L 尿素的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析氫鍵的作用）、含0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS） 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析疏水相互作用） 和含0.25%β- ME 的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值7.0，用以分析二硫鍵的作用）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Excel 2010 作圖，差異顯著性分析采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍結(jié)與解凍方式對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度是凝膠的一個(gè)重要品質(zhì)特性，好的凝膠特性不僅可以提高肉制品的品質(zhì)，還可以提高產(chǎn)品的得率。由圖1 可知，冷凍和解凍處理使肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。除了采用- 50 ℃凍結(jié)4 ℃解凍的處理組的凝膠強(qiáng)度與未經(jīng)處理的肌原纖維蛋白（CK）差異不顯著外（P＞0.05），其余處理均較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），這可能是由于凍結(jié)及解凍處理使肌原纖維蛋白發(fā)生了變性、降解等[11]。

從圖1 還可以看出，不論采用哪種解凍方式，- 50 ℃凍結(jié)的處理組其凝膠強(qiáng)度顯著高于- 18 ℃凍結(jié)的處理組（P＜0.05），同時(shí)，不論采用哪種凍結(jié)溫度，微波解凍處理組的凝膠強(qiáng)度均表現(xiàn)為最小。SAELEAW 等[3]也報(bào)道，凍結(jié)會(huì)減弱魚(yú)類肌原纖維蛋白的凝膠能力，進(jìn)而使其強(qiáng)度減小。郭恒等[1]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)肉的硬度隨著解凍溫度的升高而減小。余力等[12]研究不同的解凍方式對(duì)伊拉兔肉品質(zhì)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫解凍后的兔肉硬度下降最小，而微波解凍的硬度下降最大。

2.2 不同凍結(jié)與解凍方式對(duì)凝膠白度的影響

凝膠白度決定凝膠的外觀品質(zhì)。從圖2 可以看出，不同的凍結(jié)溫度與解凍方式均造成了凝膠白度的下降，這可能是由于凍結(jié)解凍方式造成了蛋白的變性。HWANG 等[13]也報(bào)道了凝膠白度的變化與蛋白質(zhì)的變性程度有關(guān)。

圖2 結(jié)果還顯示，不論是哪種凍結(jié)方式，微波解凍與空氣解凍均較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明這2 種解凍方式對(duì)蛋白的變性影響程度比較大，而4 ℃解凍與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），可能是因?yàn)榈蜏鼐徛鈨鰷囟确植季鶆?，不易產(chǎn)生局部過(guò)熱現(xiàn)象，對(duì)蛋白的傷害比較小。夏秀芳等[14]研究報(bào)道，凍藏過(guò)程中凝膠白度的降低可能是由于色素蛋白與肌肉蛋白的交聯(lián)，使其在蛋白提取過(guò)程中，色素蛋白去除不完全。本研究在采用相同的解凍方式下，- 18，- 50 ℃凍結(jié)的樣品，凝膠白度差異均不顯著（P＞0.05），這可能是由于凍結(jié)時(shí)間短，色素蛋白與肌肉蛋白的交聯(lián)還未發(fā)生，或者二者交聯(lián)程度不大，因此，在蛋白提取過(guò)程中，容易被除去。

2.3 不同凍結(jié)與解凍方式對(duì)凝膠持水性的影響

凝膠的持水性直接影響著凝膠制品的嫩度、多汁性等品質(zhì)。在凝膠的形成過(guò)程中，蛋白質(zhì)受熱變性、聚集、交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，良好的凝膠能夠通過(guò)毛細(xì)管作用而固定凝膠網(wǎng)絡(luò)里的水。

從圖3 可以看出，肌肉經(jīng)凍結(jié)再解凍處理后，其肌原纖維蛋白凝膠的持水性均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，但- 50 ℃凍結(jié)、4 ℃解凍的處理組與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于- 50 ℃凍結(jié)與- 18 ℃凍結(jié)相比，能在更短的時(shí)間內(nèi)迅速通過(guò)- 5～0 ℃這一最大冰晶生成帶，有效減小了蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞的損傷，再加上采用4 ℃解凍的方式，升溫慢且平穩(wěn)，解凍產(chǎn)生的能量較弱，解凍的肌肉溫度分布均勻，不易產(chǎn)生局部過(guò)熱現(xiàn)象，較好地維持了凝膠的持水性。而不論是哪種凍結(jié)方式，采用微波解凍均造成凝膠持水性顯著下降（P＜0.05），這可能是由于微波解凍能量比較高，在肌肉傳遞過(guò)程中發(fā)生局部聚集，部分蛋白變性，進(jìn)而造成蛋白形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密性比較差，持水性較弱。余文暉等[15]研究不同解凍方式對(duì)金槍魚(yú)持水性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用微波解凍方式，其持水性最低。ANESE 等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，凍藏中魚(yú)肉的持水性與硬度存在一定的正相關(guān)關(guān)系，本研究也得出類似的結(jié)論。

2.4 不同凍結(jié)與解凍方式對(duì)凝膠主要作用力分析

凝膠形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與水分子之間的二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用之間的作用力達(dá)到平衡的結(jié)果[17]。JIANG 等[18]報(bào)道，凝膠中添加不同的變性劑，能夠溶解形成凝膠的蛋白，進(jìn)而確認(rèn)維持凝膠穩(wěn)定的分子間作用力。尿素會(huì)破壞凝膠的氫鍵作用，SDS 破壞的是疏水相互作用，β- 巰基乙醇破壞的是二硫鍵。經(jīng)冷凍再解凍后的肌原纖維蛋白凝膠在不同變性劑中溶解度如圖4～6 所示。

從圖4～6 可以看出，經(jīng)不同凍結(jié)和解凍處理的肌原纖維蛋白形成的凝膠中氫鍵和疏水相互作用與對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且以- 18 ℃凍結(jié)微波解凍的處理組，對(duì)氫鍵和疏水相互作用破壞最為顯著（P＜0.05），可能是由于該處理方式造成了肌原纖維蛋白的顯著變性，這一結(jié)果與上述該處理的肌原纖維蛋白形成的凝膠的持水性和凝膠強(qiáng)度下降一致。從圖6 可以看出，經(jīng)不同處理的肌原纖維蛋白，其二硫鍵含量均高于對(duì)照組，這可能是由于不同處理使蛋白質(zhì)中的巰基轉(zhuǎn)化成了二硫鍵。同時(shí)，蛋白質(zhì)凝膠在尿素變性劑中的溶解度相對(duì)于其他2 種變性劑較小，說(shuō)明氫鍵對(duì)維持經(jīng)凍結(jié)及解凍處理后的肌原纖維熱誘導(dǎo)凝膠的貢獻(xiàn)較小，而疏水相互作用和二硫鍵交聯(lián)對(duì)分子構(gòu)象的改變和蛋白分子聚集起主要作用，是凝膠形成的主要作用力。

3 結(jié)論

在不同凍結(jié)與解凍方式下肌原纖維蛋白的凝膠特性及凝膠分子間的作用力均發(fā)生了變化，表現(xiàn)出凝膠強(qiáng)度、白度及持水性降低，采用- 18 ℃凍結(jié)、微波解凍的肌原纖維蛋白與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，各理化指標(biāo)下降最為明顯；而采用- 50 ℃凍結(jié)、4 ℃解凍的肌原纖維蛋白含量較高且凝膠特性保持較好。同時(shí)，凝膠分子間的作用力分析表明，疏水相互作用和二硫鍵是凝膠形成的主要作用力。因此，在加工、貯藏和運(yùn)輸環(huán)節(jié)中，盡可能采用較低的溫度凍結(jié)和低溫緩慢解凍，才能夠有效保持肌原纖維蛋白的凝膠特性。