張政,張學(xué)堯,張建珍,劉曉健*

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

昆蟲經(jīng)過變態(tài)獲得飛翔和生殖的能力,從而使昆蟲擴大了生存的領(lǐng)域,也因此增強了適應(yīng)能力[1]。飛蝗是一種主要分布于亞、歐、非、澳四大洲的破壞力極強的洲際性農(nóng)業(yè)害蟲。目前在治理蝗蟲工作中以化學(xué)農(nóng)藥為主,但頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥會產(chǎn)生一定程度的抗藥性[2-3],導(dǎo)致防治效果不佳,還會污染生態(tài)環(huán)境,所以研發(fā)綠色新型農(nóng)藥對我國防治蝗蟲工作具有重要意義。

幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和中腸圍食膜等的主要成分,高等動物沒有幾丁質(zhì),因此昆蟲幾丁質(zhì)代謝途徑作為重要靶標(biāo)對害蟲防治極具研究價值[4]。幾丁質(zhì)的合成中有8種酶的參與,每一種酶都起著至關(guān)重要的作用[5-6],其中研究較多的是海藻糖酶(Trehalase)和幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthase)。本課題組已有報道表明:飛蝗有4個海藻糖酶基因(LmTreS1、LmTreS2、LmTreM和LmTreM-like)[7-8]、1個葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,LmGNA)[9]、2個UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因(LmUAP1和LmUAP2)[10]和2個幾丁質(zhì)合成酶基因(LmCHS1和LmCHS2)[11-13],其中LmUAP1和LmCHS1基因負(fù)責(zé)體壁幾丁質(zhì)的合成,而LmCHS2基因負(fù)責(zé)中腸圍食膜幾丁質(zhì)的合成,RNAi分別沉默上述基因的表達(dá)后,均導(dǎo)致飛蝗高死亡率,而其他基因不是飛蝗生長發(fā)育必需的。磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase,PAGM)作為幾丁質(zhì)合成中的關(guān)鍵酶之一,僅在埃及伊蚊(Aedesaegypti)中有所報道,作者克隆獲得一條AePAGM基因,并且發(fā)現(xiàn)該基因在整個齡期均有表達(dá)[14],尚未在其他昆蟲中開展相關(guān)研究。

本文以飛蝗為研究對象,通過搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫及PCR技術(shù),得到PAGM基因全長cDNA序列,將其命名為LmPAGM;通過Real-time PCR技術(shù)分析了LmPAGM基因在5齡期的時空表達(dá)模式;利用RNAi技術(shù)研究LmPAGM的生物學(xué)功能,為基于RNAi的飛蝗防治奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

飛蝗蟲卵購自河北滄州蝗蟲養(yǎng)殖公司,在光周期為14 L:10 D,濕度為60%,溫度為30±2℃的條件下,在人工氣候箱進(jìn)行孵化。待卵孵化后,將飛蝗若蟲轉(zhuǎn)移至干凈的紗籠中,以新鮮小麥幼苗和麥麩進(jìn)行飼喂。

1.2 供試藥品

1.3 實驗方法

1.3.1 cDNA全長序列及基因組序列獲得

通過搜索飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,得到PAGM基因全長cDNA序列,將其命名為LmPAGM。為了進(jìn)一步驗證該序列,利用Primer 5.0設(shè)計特異性全長引物,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物(表1)。利用五齡飛蝗整蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增,擴增產(chǎn)物純化后連接至T載體,細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA的提取和PCR鑒定后,將產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序正確的LmPAGM使用ExPaSy 網(wǎng)站上的相關(guān)軟件計算分子量及等電點。在飛蝗基因組數(shù)據(jù)庫[15]中輸入LmPAGM基因的cDNA序列進(jìn)行Blast比對,分析該基因的內(nèi)含子與外顯子序列。

1.3.2 不同組織部位及發(fā)育日齡飛蝗磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶基因的表達(dá)

表1 LmPAGM研究中使用的引物

1.3.3 RNAi分析飛蝗磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶基因的功能

通過E-RNAi 網(wǎng)站設(shè)計含有T7序列(taatacgactcactataggg)的LmPAGMRNAi引物,利用五齡飛蝗整蟲cDNA為模板,2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行PCR擴增,擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳確定其為單一目的條帶,之后通過膠回收試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit進(jìn)行目的條帶回收,回收產(chǎn)物作為合成dsRNA的模板。運用試劑盒 HiScribeTMT7 Quick進(jìn)行dsRNA的合成。合成后的dsRNA濃度統(tǒng)一稀釋為2 μg/μL。選取N5D2飛蝗若蟲進(jìn)行dsRNA的注射,用微量注射器將LmPAGMdsRNA從飛蝗第2 和3 腹節(jié)連接處注入體腔,注射劑量為10 μg/頭,注射相同體積水的N5D2飛蝗若蟲作為對照,15頭N5D2飛蝗若蟲組成1個生物學(xué)重復(fù),共計3個生物學(xué)重復(fù)45頭,注射完畢后,將所有試蟲放置于人工氣候箱中飼養(yǎng)。CK與處理組各30頭,在N5D4取CK與處理組各9頭生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行體壁RNA的提取。反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用Real-time PCR方法對該基因的沉默效果進(jìn)行檢測,操作同上。其余試蟲用來觀察表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 飛蝗PAGM基因cDNA的序列分析

對飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了全面搜索,得到1條PAGM基因cDNA序列。利用NCBI的BLASTX分析,結(jié)果表明這段序列是PAGM的全長序列,命名為LmPAGM。并利用PCR對其進(jìn)行了全長驗證,獲得的LmPAGM全長1 512 bp,其中開放閱讀框1 491 bp,編碼497個氨基酸,5′非翻譯區(qū)和3′-非翻譯區(qū)的長度分別為99 bp和258 bp,GenBank號:MK568624利用ExPASy Proteomics website,預(yù)測LmPAGM蛋白的分子量為54.2 kDa,等電點為5.69。LmPAGM的基因組全長超過60 kb,含有17個外顯子,最小的外顯子大小為308 bp,最大的外顯子大小為71 bp,如圖1A。BLAST分析表明,LmPAGM的氨基酸序列與麗蠅蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)的氨基酸一致度最高為56%,如圖1B。

Fig.1 Genomic structure of LmPAGM and alignment with other PAGM of insects圖1 飛蝗LmPAGM基因結(jié)構(gòu)圖及其他昆蟲PAGM氨基酸比對Lm (MK568624): Locusta migratoria 飛蝗; Aa (XP-001661733.1): Aedes aegypti 埃及伊蚊;Ag (EAA04228.3): Anopheles gambiae 岡比亞按蚊; Tc (XP-973346.2): Tribolium castaneum 赤擬谷盜;Nv (XP-016837506.1): Nasonia vitripennis 麗蠅蛹集金小蜂;Dm (NP-648588.1): Drosophila melanogaster黑腹果蠅

2.2 飛蝗PAGM基因在不同組織部位的表達(dá)

根據(jù)已經(jīng)得到的飛蝗PAGM基因核苷酸序列,設(shè)計特異性的表達(dá)引物,利用 Real-time PCR對該基因在不同組織部位的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:LmPAGM在所有組織中(體壁、前腸、中腸、胃盲囊、后腸、脂肪體、馬氏管和翅)都有表達(dá),各組織之間的表達(dá)量沒有顯著差異,見圖2。

Fig.2 Expression of LmPAGM in differenttissues of the 5th instar nymphs of L. migratoria圖2 五齡飛蝗若蟲不同組織部位LmPAGM基因的表達(dá)注:IN (Integument):體壁;FG (Foregut):前腸;GC (Gastric caeca):胃盲囊; MG (Midgut):中腸;HG (Hindgut):后腸;FB (Fat body):脂肪體;MT (Malpighian tubules):馬氏管; WI (Wing):翅。

2.3 五齡期不同天數(shù)飛蝗PAGM基因的表達(dá)分析

運用Real-time PCR對PAGM基因5齡期不同天數(shù)的表達(dá)進(jìn)行了分析。實驗結(jié)果顯示:LmPAGM在每1天都有表達(dá),其中第8天的表達(dá)量最高(圖3)。

Fig.3 Expression of LmPAGM in different daysof the 5th instar nymphs of L. migratoria圖3 飛蝗五齡期不同天數(shù)LmPAGM基因的表達(dá)注:柱形圖上不同的字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.05,Tukey’s HSD;n=3.)

2.4 飛蝗PAGM基因的生物學(xué)功能分析

將dsLmPAGM注射至N5D2飛蝗若蟲,48 h后收集整蟲樣品提取RNA,利用Real-time PCR技術(shù)檢測LmPAGM基因的沉默效率,結(jié)果表明與對照組相比,注射dsLmPAGM組中LmPAGM的表達(dá)被顯著沉默,沉默效率達(dá)70.3%(圖4A)。30頭對照在第8天成功羽化為成蟲,注射dsLmPAGM的實驗組在第8天有25頭成功羽化為成蟲,11頭試蟲出現(xiàn)死亡,注射dsLmPAGM組飛蝗致死率約為30%(圖4B)。

A：LmPAGM沉默效率檢測；B：LmPAGM沉默后的表型圖Fig.4 Effects of dsLmPAGM injected into the 5th instar nymphs on theexpression of LmPAGM and the development of L. migratoria圖4 注射LmPAGM基因的dsRNA至5齡期若蟲后對LmPAGM基因表達(dá)量及發(fā)育的影響

3 討論

昆蟲幾丁質(zhì)合成通路從血淋巴中的海藻糖被轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)開始,由8種酶依次催化生成葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸、UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc),最后UDP-GlcNAc在幾丁質(zhì)合成酶的作用下合成幾丁質(zhì)[16]。其中,PAGM催化N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸生成N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸。我們從不完全變態(tài)昆蟲飛蝗中首次獲得了磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶基因的cDNA序列,命名為LmPAGM,該基因編碼497個氨基酸,和埃及伊蚊,岡比亞按蚊,赤擬谷盜,麗蠅蛹集金小蜂,黑腹果蠅PAGM氨基酸一致度為52%～56%。

本研究采用Real-time PCR技術(shù)對LmPAGM基因在五齡若蟲期的時空表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)該基因除了在體壁、前腸、中腸、后腸和翅這些含有幾丁質(zhì)的部位表達(dá)外,在所檢測的其他組織中(胃盲囊、脂肪體和馬氏管)均有表達(dá),且沒有顯著差異。從果糖-6-磷酸到UDP-GlcNAc也被稱氨基己糖途徑,已有研究報道UDP-GlcNAc是包括幾丁質(zhì)在內(nèi)的許多重要物質(zhì)合成的前體,例如細(xì)菌合成肽聚糖、革蘭氏陰性菌合成脂多糖,真菌合成細(xì)胞壁的甘露糖蛋白等,以及真核生物蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的N-連接的糖基化過程也與UDP-GlcNAc有關(guān)[17]。PAGM基因除存在于昆蟲外,還存在于原核生物和包括人類[18]等哺乳動物在內(nèi)的許多真核生物中,因此推測飛蝗LmPAGM基因在沒有幾丁質(zhì)的胃盲囊、脂肪體和馬氏管中的表達(dá),可能是由于其參與了蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的N-連接的糖基化過程。LmPAGM在第8天的體壁表達(dá)量最高,這與飛蝗幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵基因LmUAP1[19]和LmCHS1[19]的變化規(guī)律相似,即蛻皮前表達(dá)較蛻皮中的表達(dá)顯著上升。對五齡期飛蝗若蟲的體壁進(jìn)行切片和H&E染色,表明蛻皮前是新表皮開始形成時期,在這段發(fā)育期舊的內(nèi)表皮逐漸被消化吸收,新的并沒有硬化的表皮大量形成并劇烈褶皺,因此與幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因的高表達(dá)與新表皮形成需要大量幾丁質(zhì)合成有關(guān)[19]。通過RNAi實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,注射dsLmPAGM組LmPAGM的表達(dá)可以顯著沉默,但是僅有約30%的飛蝗會出現(xiàn)死亡表型,本課題組已有研究表明幾丁質(zhì)合成關(guān)鍵基因LmUAP1[19]和LmCHS1[19]負(fù)責(zé)新表皮幾丁質(zhì)的形成,沉默上述基因的表達(dá)后新表皮幾丁質(zhì)含量較對照組顯著下降,因此推測LmPAGM基因可能在幾丁質(zhì)合成過程中具有類似的功能。RNAi具有特異性及高效性等特點,在害蟲的防治中具有潛在的應(yīng)用價值。篩選和鑒定對害蟲生長發(fā)育至關(guān)重要的基因是應(yīng)用RNAi技術(shù)開發(fā)新型殺蟲劑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[20],本文的實驗結(jié)果為進(jìn)一步探討PAGM基因在幾丁質(zhì)合成途徑中功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),并為基于RNAi的飛蝗防治提供了理論依據(jù)。