李甘，李勇，王創(chuàng)建，杜芳芳，雙少敏*

(1.山西大學 化學化工學院，山西 太原 030006;2.山西大學 環(huán)境科學研究所，山西 太原 030006)

0 引言

黑豆(Glycinemax)又稱烏豆，是我國傳統(tǒng)種植的農作物。黑豆不但營養(yǎng)價值高，而且具有藥用價值[1]?！侗静菥V目》中記載：“常食黑豆，可百病不生”，具有滋補肝腎，軟化血管等功效[2-3]。

黑豆種皮中因含有豐富的花色苷類物質而呈現(xiàn)黑色。花色苷是賦予植物顏色的天然水溶性色素，屬于類黃酮化合物。研究報道已從黑豆皮中分離得到了多種花色苷，其中矢車菊素 3-O-葡萄糖苷是黑豆皮中最主要的活性成分之一[4-6]?；ㄉ兆鳛楹诙蛊ど氐闹饕煞?，除了具有很強的抗氧化能力[7]，能有效清除體內自由基，還有降血糖[8]、抗癌[9]、抑制脂肪[10-11]等活性，其中降血糖作用引起了學者們的高度關注。研究糖尿病的過程中發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶抑制劑在2型糖尿病的治療過程中發(fā)揮著重要作用，是近年來糖尿病藥物開發(fā)研究的一個熱點[12]。

近年來，醋泡黑豆作為一種功能性保健食品引起廣泛關注，因其集合了黑豆和陳醋的營養(yǎng)和保健作用。有關醋泡黑豆的制備條件和功能特性變化方面的研究已有報道[13-15]。熊太銀等[13]采用正交試驗和改良試驗探索醋泡黑豆的最佳工藝參數(shù)，研制出適合大眾口味的黑豆休閑食品。張月圓等[16]研究醋浸可改變黑豆各蛋白組分的含量和對應多肽的ACE(血管緊張素轉化酶)抑制活性。江帆等[15]表明醋泡黑豆制備條件對醋泡黑豆的抗氧化特性有顯著影響。但有關醋泡黑豆皮的研究尚少見報道。本文研究了醋泡方法對黑豆皮中矢車菊素3-O-葡萄糖苷的提取量及黑豆皮提取物的抗氧化能力和對α-葡萄糖苷酶的抑制能力的影響，為黑豆皮花色苷的開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆皮、白醋選購于太原市藍海農貿市場。

花色苷標準品：矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cy3-O-glu)購于挪威多酚公司；乙醇、甲醇、鹽酸、石油醚、乙酸乙酯，均為分析純。高效液相色譜(HPLC)所用甲醇(色譜級)，2, 2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，阿卡波糖水合物購于阿拉丁公司。α-D-葡萄糖苷酶[EC 3.2.1.20]，4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(4-MUG)購自西格瑪奧德里奇公司。

1.2 儀器

安捷倫HPLC-1200高效液相色譜儀(配有四元泵、自動進樣器、可變波長紫外檢測器和色譜工作站)，熒光光度計(英國，愛丁堡公司)，紫外-可見分光光度計(珀金埃爾默儀器上海有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(Heidolph/G3)，超聲波清洗器(天鵬電子新技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 矢車菊素3-O-葡萄糖苷標準溶液配制

準確稱取標準品花色苷Cy 3-O-glu 2.00 mg，將其溶于2.00 mL 含體積分數(shù)為1%鹽酸的甲醇溶液中，配成1.00 mg/mL的標準儲備液。從標準儲備液中吸取一定量，用體積分數(shù)為1%鹽酸的去離子水溶液稀釋成：5、50、100、250、500 μg/mL標準品待測液，用0.45 μm濾膜過濾，取20 μL上樣。

1.3.2 花色苷的提取

1.3.2.1 黑豆皮花色苷的提取

稱取黑豆皮樣品20 g，加入200 mL含體積分數(shù)為1%鹽酸的乙醇溶液，室溫下超聲處理3次，每次15 min；布氏漏斗過濾，得濾液。濾渣再用200 mL體積分數(shù)為1%鹽酸的乙醇溶液重復提取2次，將3次濾液合并，40℃下真空濃縮去除乙醇，然后用體積分數(shù)為1%鹽酸的去離子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏備用。

1.3.2.2 醋泡黑豆皮花色苷的提取

稱取黑豆皮樣品20 g，使用白醋浸泡2 d[13]。重復以上提取步驟，最終用體積分數(shù)為1%鹽酸的去離子水定容至5 mL，于冰箱中冷藏備用。

1.3.3 檢測波長的確定

用體積分數(shù)為1%鹽酸水溶液配制少量黑豆皮提取液，用紫外可見分光光度計200 nm～800 nm的范圍內對其進行掃描，得黑豆皮提取液的吸收光譜圖。同時對標準品花色苷溶液，用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，得到花色苷Cy 3-O-glu吸收光譜圖，確定其最大吸收波長。

1.3.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)。流動相A為水(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸)，流動相B為甲醇。流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30℃，檢測波長520 nm。梯度條件：0～50 min，5%～100%B；50～60 min，100%B 沖柱。

1.3.5 加標回收率的測定

準確稱取已知花色苷Cy 3-O-glu含量的黑豆皮原料20 g，準確稱取3份，分別加入與供試樣品中花青素含量相同的花色苷Cy 3-O-glu對照品，按1.3.2中花色苷的制備方法制備，按 1.3.4中確定的方法準確測定，計算平均回收率。

1.4 生物活性的測定

1.4.1 抗氧化活性-ABTS法

ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時ABTS+的產生會被抑制，因其在734 nm或405 nm有最大吸收，所以一般選擇734 nm或405 nm測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。

參照Bellumori等[17]的方法使用ABTS+模型測定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。取100 μL的樣品溶液加入2 mL ABTS溶液避光反應2 min，空白實驗取100 μL水加入2 mL ABTS溶液避光反應2 min，然后測定在734 nm處吸光度值。以維生素C作為陽性對照。根據(jù)不同濃度的樣品的清除率可計算出半抑制濃度IC50。

依據(jù)公式(1)，可以計算出ABTS+的清除率：

(1)

A0為空白溶液的吸光度值，At為樣品與ABTS 反應后的吸光度值。

ABTS溶液的配置：稱取54.8 g ABTS溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)，加入1 g的MnO2，活化20 min。取2 mL活化好的溶液離心，用磷酸緩沖溶液稀釋上清液，使其A734(t0)=0.800±0.02 nm。

1.4.2 抗氧化活性-DPPH法

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，當有自由基清除劑的存在時，由于與其單電子配對而使其在517 nm處的吸收消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關系，因而可使用分光光度計進行快速定量分析。

參考Zill-E-Huma[18]的方法使用DPPH+模型測定黑豆皮花色苷的抗氧化活性。稱取40 mg的DPPH溶于100 mL的甲醇中，50 μL的樣品溶液與2 mL的DPPH溶液避光反應30 min，空白實驗取50 μL水與2 mL DPPH溶液避光反應30 min。在517 nm處測量吸光度值，以維生素C作為陽性對照。根據(jù)不同濃度的樣品的清除率可計算出IC50。

依據(jù)公式(2)，可以計算出DPPH+的清除率：

(2)

A0為空白溶液的吸光度值，At為樣品與DPPH 反應后的吸光度值。

1.4.3α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以4-MUG為反應底物，4-MUG被α-葡萄糖苷酶水解后產生的4-甲基傘形酮(4-MU)具有熒光，可被檢測。而α-葡萄糖苷酶抑制劑的存在會抑制4-MUG的水解，減少4-MU的產生。通過測定樣品加入前后熒光變化可以判斷出黑豆皮提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響[12,19]。

按照廖暉等[12,20]的方法測定樣品的α-葡萄糖苷酶的抑制作用。將黑豆皮花色苷提取物20 μL與40 μL制備的1 μg/mL酶溶液和50 μL 10 mmoL/L 4-MUG溶液在Tris緩沖液(pH 6.9)。將混合物搖勻，在37℃溫育20 min。在λex380 nm，λem400 nm處測定熒光值。α-葡萄糖苷酶對照組含有緩沖液20 μL，底物溶液50 μL和酶溶液40 μL；空白組含有黑豆皮花色苷提取物20 μL，緩沖液20 μL和酶溶液40 μL，而空白對照組含有緩沖液和酶溶液。阿卡波糖為陽性對照。根據(jù)不同濃度的樣品的抑制率可計算出IC50。

依據(jù)公式(3)，可以計算出α-葡萄糖苷酶的抑制率：

(3)

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

圖1a是標準品Cy 3-O-glu在體積分數(shù)為1%鹽酸水溶液中的吸收光譜圖，從譜圖中可以發(fā)現(xiàn)其在 520、360、280 nm處有吸收峰。圖1b是黑豆皮提取物在體積分數(shù)為1%鹽酸水溶液中的吸收光譜圖，從譜圖中可以看出黑豆皮提取物分別在520、360、280 nm處有吸收峰，而 520 nm為花青素類色素的特征吸收峰。因此，選擇520 nm作為黑豆皮提取物中花色苷HPLC的檢測波長。

Fig.1 UV-visible absorption spectrogram of Cy 3-O-glu (a), black soya bean hulls extraction (b)圖1 標準品花色苷Cy 3-O-glu(a)，黑豆皮提取液(b)的紫外-可見吸收光譜圖

2.2 黑豆皮花色苷的鑒定

圖2為醋泡前后黑豆皮花色苷提取物以及標準品Cy 3-O-glu的HPLC譜圖。經HPLC譜圖分析，并與標準品(圖2a)進行對比，確定峰1為Cy 3-O-glu。

Fig.2 HPLC chromatograms of Cy 3-O-glu (a), untreated soybean skin (b) and vinegar soak black soybean hulls (c)圖2 標準品花色苷Cy 3-O-glu(a)，未處理黑豆皮(b)及醋泡黑豆皮(c)的HPLC色譜圖

2.3 方法性能指標

2.3.1 線性關系與檢測限

由1.3.1配置的標準系列溶液在1.3.4的色譜條件下，經HPLC測得Cy 3-O-glu的標準系列溶液的色譜峰的峰面積。以Cy 3-O-glu的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，繪制標準曲線。結果表明Cy 3-O-glu在5 μg/mL～500 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y=29.668x+125.96，R2=0.999 1，標準曲線如圖3所示。

經HPLC測定，當花色苷Cy 3-O-glu峰高為儀器響應噪聲的3倍量時，檢測限為50 ng/mL( S/N=3)。

2.3.2 精密度的測定

取濃度為100 μg/mL標品待測液，連續(xù)進樣5次，每次進樣20 μL。通過HPLC測得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計算RSD為0.6%。結果說明儀器具有良好的精密度。

2.3.3 穩(wěn)定性的測定

取黑豆皮提取液分別于放置0、2、4、8、12 h后各進樣一次，通過HPLC測得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計算RSD為0.6%。結果表明在12 h內樣品具有很好的穩(wěn)定性。

Fig.3 Standard curve of Cy 3-O-glu圖3 花色苷Cy 3-O-glu標準曲線

2.3.4 重復性的測定

準確稱取同一批黑豆皮5份，每份均為20 g。重復樣品的提取操作，即1.3.2.1的操作。通過HPLC測得的花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，計算RSD為2.8%。結果表明該實驗具有良好的重現(xiàn)性。

2.3.5 加標回收的測定

按1.3.2中花色苷的制備方法制備并測定。平均回收率為96.47%，計算RSD為1.25%，結果如表1所示。結果表明該實驗回收率良好。

2.4 醋泡黑豆皮前后花色苷的含量測定

黑豆皮花青素提取液按1.3.2 中樣品處理方法制備，通過HPLC測定醋泡前后2個供試樣品，可以得到花色苷Cy 3-O-glu的峰面積，通過標準曲線計算得到樣品中花色苷Cy 3-O-glu的含量，結果見表2。此外，通過色譜譜圖分析，醋泡黑豆皮(圖2c)峰1的峰面積比未處理的黑豆皮(圖2b)的峰1峰面積高出很多。結果表明，醋泡方法可以提高黑豆皮花色苷提取物中Cy 3-O-glu的含量。

表1 樣品回收率的測定(n=3)

表2 不同工藝的黑豆皮花色苷Cy 3-O-glu含量的測定(n=3)

2.5 生物活性的測定及比較

2.5.1 醋泡前后黑豆皮提取液抗氧化活性的測定及比較

通過測定某物質清除自由基的能力，即可表征其抗氧化活性強弱[21-22]。由于同一種具有抗氧化活性的物質在不同的抗氧化測定體系中表現(xiàn)出的抗氧化活性不同，因此全面地評價一種物質的抗氧化能力不能只采用一種評價方法。因此，采用了ABTS，DPPH兩種方法進行抗氧化活性的分析。

圖4、圖5分別顯示了醋泡處理前后黑豆皮花色苷提取物及對照品維生素C對ABTS+和DPPH+的清除效果。黑豆皮花青素提取物和維生素C對ABTS+，DPPH+均有清除作用，且清除率與質量濃度均呈線性相關，即隨著質量濃度的增加，自由基的清除能力增強。樣品以及對照品對兩種自由基清除能力的半抑制量IC50通過回歸方程得到，列于表3中。

Fig.4 ABTS radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)圖4 不同工藝黑豆皮花青素以及維生素C的ABTS自由基清除能力

Fig.5 DPPH radical scavenging activities of anthocyanins fromblack soybean hulls with different technologies (a) and vitamin C (b)圖5 不同工藝黑豆皮花青素以及維生素C的DPPH自由基清除能力

Fig.6 Inhibition of a-glucosidase of anthocyanins fromblack soybean hulls with different processes (a) and acarbose (b)圖6 不同工藝黑豆皮花青素以及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

表3 不同工藝的黑豆皮花色苷生物活性的IC50值

兩種自由基的清除作用均有以下的趨勢，IC50值從小到大為：醋泡黑豆皮<未經處理黑豆皮<維生素C。醋泡黑豆皮花青素提取物對ABTS+，DPPH+清除能力的IC50分別為陽性對照的5.92和1.83倍。結果顯示DPPH法的清除能力低于ABTS法，這是由于DPPH比ABTS有更強的選擇性，它不與B環(huán)上無羥基的黃酮類物質發(fā)生反應。綜上分析，兩種自由基清除的結果說明黑豆皮花色苷的抗氧化能力遠高于維生素C，且醋泡黑豆皮極大提高了其抗氧化能力。

2.5.2α-葡萄糖苷酶抑制能力的測定及比較

黑豆皮花色苷提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響結果如圖6所示。醋泡處理前后黑豆皮花色苷提取物及對照品阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶均有抑制的效果，且抑制率與質量濃度均呈線性相關，即隨著質量濃度的增加，對α-葡萄糖苷酶的抑制能力增強。樣品以及對照品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的IC50通過回歸方程得到，列于表3中。IC50值從小到大依次為：阿卡波糖<醋泡黑豆皮<未經處理黑豆皮。醋泡前后黑豆皮花色苷提取物的IC50值低于阿卡波糖，可能因為黑豆皮花青素提取物未經純化，存在其他物質影響了其抑制能力。結果說明黑豆皮花色苷有作為α-葡萄糖苷酶的抑制劑的潛力，而較于未處理的黑豆皮，醋泡黑豆皮可顯著提高對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。

3 結論

本文研究了醋泡對黑豆皮中花色苷Cy 3-O-glu提取量的影響及對花色苷提取物生物活性的影響。結果表明，Cy 3-O-glu為黑豆皮提取物中的主要活性成分之一，醋泡黑豆皮可提高提取物中Cy 3-O-glu的含量。生物活性測定的結果表明，與未醋泡的黑豆皮相比，醋泡黑豆皮提取物對自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力較強。綜上所述，醋泡黑豆皮可極大提高抗氧化能力和對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可作為一種潛在的天然抗氧化和降血糖資源，具有開發(fā)為預防糖尿病及其并發(fā)癥的保健品的潛力。