黃赟 李智文 黃晅昱 劉晨

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種在中國(guó)人群中高發(fā)、難治的常見腫瘤，近幾十年來，肝癌患者的總生存率未有提高[1]。目前，臨床上用于晚期HCC的有效治療方法和策略非常有限，包括手術(shù)切除和肝移植、放療、全身化療和基于分子診斷的靶向治療等[2]。但大多數(shù)HCC患者在確診時(shí)已接近腫瘤終末期，并且HCC容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，研發(fā)新型抗HCC藥物具有十分重要的臨床意義。和厚樸酚（honokiol，HNK）作為傳統(tǒng)中藥厚樸的有效成分之一，具有廣泛的抗腫瘤活性。已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)，HNK可以有效抑制乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤和黑色素瘤等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)展[3-6]，但在肝細(xì)胞癌中，HNK是否有抑制腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的能力仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證闡明。本研究旨在探索HNK對(duì)于肝癌細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移能力的影響，試圖尋找合理的分子機(jī)制對(duì)其進(jìn)行解釋。我們的研究結(jié)果表明HNK可以作為一種天然、安全、有效的肝癌治療輔助藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K（Tyr458）、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT（Ser473）、波形蛋白（Vimentin）、上皮-鈣依賴性粘附蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)-鈣依賴性粘附蛋白（N-cadherin）抗體均購自美國(guó)CellSignaling Technology公司?？垢视腿?3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國(guó)Proteintech公司。牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibico公司。草酸銨結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶公司。蘇木精染液、伊紅染液購自北京雷根生物技術(shù)公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購自美國(guó)康寧公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌Hep3B細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右密度時(shí)先更換為無血清培養(yǎng)基，再給予藥物處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物模型建立

4～5周齡的雌性裸鼠（BALB/C-nu/nu；18～20 g）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，均飼養(yǎng)在福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。肺轉(zhuǎn)移模型設(shè)計(jì)如下：每只裸鼠通過尾靜脈注射濃度為2.0×106的Hep3B細(xì)胞。1周后，將小鼠隨機(jī)分成試驗(yàn)組（n=5）和對(duì)照組（n=5），每日腹腔注射HNK（50 mg/kg）或空載溶劑，持續(xù)5周。在第6周造模結(jié)束時(shí)處死并完整取出肺組織。統(tǒng)計(jì)肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)并進(jìn)行后續(xù)蘇木精和伊紅（H&E）染色。

1.4 H&E染色

裸鼠完整肺組織用4%的多聚甲醛固定、脫水后浸蠟、包埋、切片。H&E染色染色前先烤片1小時(shí)，再用梯度乙醇和二甲苯脫蠟至水化。接著用蘇木精染色5～7分鐘，再用伊紅染色3分鐘。最后脫水、透明、封片。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

在HNK刺激后，將細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至緊密接壤時(shí)，用移液槍頭在細(xì)胞上輕輕劃過直線，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）小心洗去細(xì)胞碎片；之后加入2 mL維持培養(yǎng)基（含2%FBS的DMEM）繼續(xù)培養(yǎng)。使用顯微鏡（200×）在不同刺激時(shí)間點(diǎn)（0 h，48 h）觀察同一位置細(xì)胞遷移情況變化。

1.6 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

使用Transwell試驗(yàn)測(cè)定以評(píng)估細(xì)胞遷移能力變化。將細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）置于transwell裝置的上室中，用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；下室用500 μL含10%FBS的DMEM填充。將上述裝置在37℃下孵育18小時(shí)。孵育期結(jié)束后，將固定遷移至上室隔膜下表面的細(xì)胞連同完整底膜一起剪切下來，并用2.0%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下選擇5個(gè)不同位點(diǎn)拍照并統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白水平

4℃條件下在細(xì)胞中加入蛋白裂解液，30分鐘后收集細(xì)胞裂解液，超聲碎裂細(xì)胞，離心（12 000 g，4℃，15分鐘）后測(cè)定蛋白濃度，剩余樣品混合上樣緩沖液并置于100℃中變性5分鐘。配置10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移PVDF膜上，用相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育（GAPDH稀釋濃度為1：2 000，其余抗體均為1：1 000），TBST洗滌后用相應(yīng)二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影并進(jìn)行灰度測(cè)定及統(tǒng)計(jì)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用（）表示。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNK對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移能力的影響

首先用不同濃度的HNK（20 μmol/L，30 μmol/L）刺激Hep3B細(xì)胞24小時(shí)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，HNK處理組中Hep3B細(xì)胞的遷移能力降低[0 μmol/L：（45.0±5.8）%；20 μmol/L：（76.7±4.4）%；30 μmol/L：（92.0±1.5）%；0 μmol/L：20 μmol/L，P=0.012；0 μmol/L：30 μmol/L，P=0.001；20 μmol/L：30 μmol/L，P=0.030]，并顯示出濃度依賴性趨勢(shì)（見圖1A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示：與對(duì)照組相比，HNK處理后的Hep3B細(xì)胞遷移數(shù)目減少[0 μmol/L：（142.6±10.1）%；20 μmol/L：（74.0±6.4）%；30 μmol/L：（25.0±3.8）%；0 μmol/L：20 μmol/L，P=0.005；0 μmol/L：30 μmol/l，P=0.001；20 μmol/L：30 μmol/L，P=0.003]，并顯示出濃度依賴性趨勢(shì)（見圖1B）。以上結(jié)果表明HNK具有抑制體外HCC細(xì)胞遷移的能力。

圖1 HNK在體外對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

2.2 HNK對(duì)Hep3B細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響

我們使用Hep3B細(xì)胞構(gòu)建裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型以評(píng)估HNK對(duì)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)的影響（見圖2）。H&E染色結(jié)果及肺轉(zhuǎn)移瘤的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均顯示：HNK治療組中的裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目低于對(duì)照組[（13.0±3.97）：（2.20±1.01）個(gè)，P=0.021）]。上述結(jié)果證實(shí)，HNK具有抑制體內(nèi)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。

圖2 HNK在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.3 HNK對(duì)Hep3B細(xì)胞PI3K/AKT通路及EMT相關(guān)蛋白的影響

如圖3所示，我們觀察到HNK在Hep3B細(xì)胞中能降低PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平，證實(shí)了HNK可以抑制Hep3B細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路的變化進(jìn)一步影響了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括波形蛋白（Vimentin）、上皮-鈣依賴性粘附蛋白（E-cadherin）和神經(jīng)-鈣依賴性粘附蛋白（N-cadherin）的改變。結(jié)果提示：隨著PI3K/AKT通路信號(hào)的減弱，E-cadherin蛋白的表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)受到抑制，說明HNK可以通過抑制PI3K/AKT通路逆轉(zhuǎn)EMT。詳見表1。

表1 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量（，n=3）

表1 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量（，n=3）

注：與0μm HNK治療組比較，*P＜0.05；與20μmol/L HNK治療組比較，#P＜0.05

images/BZ_138_213_1101_2303_1148.pngp-PI3K/PI3K 1.05±0.16 0.15±0.03* 0.07±0.02*#p-AKT/AKT 0.83±0.12 0.35±0.04* 0.20±0.05*#Vimentin/GAPDH 0.68±0.11 0.21±0.06* 0.11±0.03*#N-cadherin/GAPDH 0.93±0.13 0.62±0.07* 0.18±0.04*#E-cadherin/GAPDH 0.22±0.05 0.41±0.07* 0.89±0.14*#

圖3 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的Western blot結(jié)果

3 討論

中草藥是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，其具有副作用較小、應(yīng)用廣泛等有點(diǎn)。HNK作為傳統(tǒng)中草藥厚樸的有效成分之一，已被證實(shí)在多種腫瘤中具有廣泛的抗癌作用[3，7-8]。本研究證實(shí)，HNK能夠在體外有效抑制Hep3B細(xì)胞的遷移能力；在體內(nèi)機(jī)制研究中，人肝癌細(xì)胞裸鼠肺部成瘤模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HNK治療抑制了Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺部成瘤的能力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同驗(yàn)證了HNK對(duì)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

HCC作為一種高發(fā)、難治的常見病，其高死亡率和低治愈率在很大程度上是由于晚期腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前普遍認(rèn)為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制其中起著重要作用，在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性等領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛而深入的研究[9-10]。因此，我們推測(cè)HNK對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的抑制作用有可能與抑制EMT有關(guān)。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)：HNK治療后，上皮標(biāo)記物E-鈣粘蛋白上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白（一種細(xì)胞骨架蛋白）和N-鈣粘蛋白（一種細(xì)胞表面蛋白）則相應(yīng)下調(diào)，證實(shí)了HNK能夠通過抑制肝癌細(xì)胞的EMT來抑制腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/AKT通路是一個(gè)經(jīng)典的關(guān)鍵致癌信號(hào)通路，其影響腫瘤發(fā)展的多個(gè)關(guān)鍵方面，包括細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、增殖、細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)和侵襲性[11-12]。PI3K/AKT通路的異常激活在HCC中頻繁被報(bào)道，以通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平升高為特征。既往相關(guān)研究表明，HNK能夠通過降低相關(guān)蛋白磷酸化水平抑制PI3K/Akt途徑[13-14]。本研究結(jié)果證明了HNK在HCC中下調(diào)了PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，并最終抑制了EMT，這與之前報(bào)道的PI3K/Akt通路也參與了EMT的誘導(dǎo)相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[15-16]。因此，HNK作為一種天然的PI3K抑制劑，具有有效抗肝細(xì)胞癌的作用。

綜上所述，我們得出結(jié)論：HNK通過抑制PI3K/AKT通路逆轉(zhuǎn)EMT，進(jìn)而抑制了HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。NHK作為一種天然高效的抗癌藥物，在HCC治療中具有廣闊的研究前景和巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。