劉秀珍 曹春梅 張冰 劉靜民

1 清華大學(xué)體育部（北京100084）

2 巢湖學(xué)院體育學(xué)院（合肥238000）

勞力性熱射?。╡xertional heat stroke，EHS）是一種危及生命的疾病，臨床上表現(xiàn)為核心溫度迅速升高超過(guò)40.5℃，伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常及包括急性腎損傷在內(nèi)的多器官功能障礙[1]。它對(duì)運(yùn)動(dòng)員生命安全造成極大的挑戰(zhàn)，是馬拉松等耐力運(yùn)動(dòng)員最常見(jiàn)的猝死原因[2]。勞力性熱射病病情進(jìn)展迅速，如果在30分鐘內(nèi)沒(méi)有迅速得到降溫處理，并發(fā)多器官功能障礙及導(dǎo)致死亡的機(jī)率會(huì)顯著增加[3]。因此，熱射病發(fā)作后，進(jìn)行快速冷卻治療是確保熱射病患者存活的重要手段[4]。Wohlfert 等的研究表明，冷水浸泡（cold water immersion，CWI）是降低熱射病患者核心溫度最快速的方法，可以使患者的存活率提升到接近100%[5]。

熱射病病理生理學(xué)機(jī)制涉及熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能異常、水鹽代謝失衡等方面，其中腎臟水鹽代謝失衡與體溫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)熱射病的研究主要集中在熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能異常等方面，有關(guān)腎臟水鹽代謝及熱休克反應(yīng)的研究很少。杜名的研究認(rèn)為腎臟水通道蛋白與人類正常生理活動(dòng)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，對(duì)水通道蛋白理論進(jìn)行研究具有巨大的發(fā)展?jié)摿6]。但是，迄今為止，國(guó)內(nèi)尚無(wú)冷卻治療對(duì)熱射病患者腎臟水鹽代謝調(diào)節(jié)方面的直接探索，冷卻治療在降溫過(guò)程中，是否通過(guò)改變腎臟水通道蛋白（AQP2）的合成來(lái)改善水代謝，進(jìn)而通過(guò)抗脫水途徑恢復(fù)下丘腦體溫調(diào)控作用并促進(jìn)熱射病病情轉(zhuǎn)歸的病理生理學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此，本研究針對(duì)勞力性熱射病大鼠冷卻治療期間腎臟水通道蛋白基因轉(zhuǎn)錄中AQP2 mRNA及蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行研究，明確水通道蛋白在熱射病水代謝穩(wěn)態(tài)中的作用，為今后研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)選用51 只7 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，體重230～270 g，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK（京）2016-0011]。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，室溫20℃～25℃，濕度45%～50%，光照比12 h∶12 h。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 天，隨機(jī)分為6 組，常溫對(duì)照組（C，n=8）、高溫運(yùn)動(dòng)即刻組（E，n=9）、高溫運(yùn)動(dòng)休息1組（ER1，n=9）、高溫運(yùn)動(dòng)冷浸1組（EC1，n=8）、高溫運(yùn)動(dòng)休息2 組（ER2，n=9）和高溫運(yùn)動(dòng)冷浸2 組（EC2，n=8）。

1.2 勞力性熱射病大鼠模型建立與冷卻治療

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練

參加高溫運(yùn)動(dòng)的大鼠在常溫下飼養(yǎng)，并在常溫下進(jìn)行為期5天的適應(yīng)性訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練跑臺(tái)坡度為0。開(kāi)始運(yùn)動(dòng)速度為18 m∕min，每天遞增2 m∕min，最后達(dá)到26 m∕min；開(kāi)始運(yùn)動(dòng)時(shí)間30 min，每天遞增10 min，最后達(dá)到60 min。適應(yīng)性訓(xùn)練安排見(jiàn)表1。

表1 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練安排

1.2.2 勞力性熱射病大鼠模型建立

適應(yīng)性訓(xùn)練后休息3 天，在環(huán)境密閉的高溫高濕實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一次性高溫力竭運(yùn)動(dòng)建立勞力性熱射病大鼠模型。高溫高濕實(shí)驗(yàn)室溫度控制為36℃± 1℃，濕度控制為75% ± 5%。依據(jù)Bedford 最大攝氧量表[7]及高溫運(yùn)動(dòng)大鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠高溫運(yùn)動(dòng)時(shí)跑臺(tái)坡度為5°，速度為28 m∕min，相當(dāng)于60%～80%最大攝氧量的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。依據(jù)（1）至（4）確定大鼠進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)至力竭并使直腸溫度上升到約42℃時(shí)為勞力性熱射病建模成功：（1）Bouchama 等經(jīng)典型熱射病狒狒模型[8]；（2）Lam 等經(jīng)典型熱射病大鼠模型[9]；（3）Chang 等高溫運(yùn)動(dòng)至力竭誘導(dǎo)勞力性熱射病大鼠模型[10]；（4）勞力性熱射病經(jīng)常在長(zhǎng)時(shí)間耐力性運(yùn)動(dòng)（馬拉松、越野賽及自行車公路賽等）中體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)不堪重負(fù)時(shí)發(fā)生，在力竭或完賽的情況下發(fā)生率更高[11，12]。大鼠力竭標(biāo)準(zhǔn)為不能維持預(yù)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，在跑臺(tái)后擋板滯留時(shí)，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3 次無(wú)效。采用北京搏貝科技有限公司JNT-200型鼠肛溫計(jì)測(cè)量高溫運(yùn)動(dòng)前及高溫運(yùn)動(dòng)至力竭后大鼠直腸溫度。測(cè)量方法為：將溫度計(jì)探頭插入大鼠直腸6.5 cm，固定探頭，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.2.3 冷水浸泡實(shí)驗(yàn)

依據(jù)（1）至（3）建立大鼠冷水浸泡方案：（1）McDermott等[13]治療熱射病常用冷卻方式的冷卻速率；（2）Riana 等[14]海軍陸戰(zhàn)隊(duì)馬拉松運(yùn)動(dòng)員勞力性熱射病快速冷卻流程；（3）Stewart 等[15]勞力性熱射病患者冷卻案例設(shè)定大鼠冷水浸泡預(yù)實(shí)驗(yàn)。冷水浸泡預(yù)實(shí)驗(yàn)選取19只EHS 大鼠，8 只死亡，11 只存活。結(jié)果如下：2 只2℃冰水浸泡4 s 的大鼠死亡；2 只9℃冷水浸泡10 min 的大鼠死亡；1 只19℃冷水浸泡10 min 的大鼠死亡；4 只2℃冰水浸泡2 s的大鼠，2只死亡，另2只存活；4只9℃冷水浸泡5 min的大鼠，1只死亡，3只存活；6只19℃冷水浸泡5 min的大鼠全部存活。為了確保EHS大鼠冷水浸泡實(shí)驗(yàn)的安全有效性，最終將本實(shí)驗(yàn)冷水浸泡溫度設(shè)定為19℃，實(shí)際溫度為18℃～20℃；冷水浸泡時(shí)間設(shè)定為5 min。大鼠休息溫度設(shè)定為室溫20℃，實(shí)際溫度為19℃～21℃。

在高溫運(yùn)動(dòng)至力竭后，ER1 組大鼠常溫休息5 min；EC1 組大鼠冷浸5 min；ER2 組大鼠常溫休息65 min（5 min＋60 min）；EC2 組大鼠冷浸5 min，常溫休息60 min。冷浸或常溫休息5 min 后，及常溫休息60 min 后立即測(cè)量大鼠直腸溫度。冷卻速率用大鼠冷浸或休息5 min 期間單位時(shí)間內(nèi)體溫的減少量來(lái)表示，其計(jì)算公式為:

1.3 取材及處理

高溫運(yùn)動(dòng)即刻組在高運(yùn)動(dòng)后即刻取材，常溫對(duì)照組與高溫運(yùn)動(dòng)即刻組同時(shí)取材。高溫運(yùn)動(dòng)后，高溫運(yùn)動(dòng)休息1 組、高溫運(yùn)動(dòng)冷浸1 組、高溫運(yùn)動(dòng)休息2 組和高溫運(yùn)動(dòng)冷浸2組在完成相應(yīng)的休息或冷浸實(shí)驗(yàn)后取材。采用10%水合氯醛按照0.32 ml∕100 g體重的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，選取腹主動(dòng)脈取血；摘取腎臟放入液氮中迅速冷凍及凍存。

1.4 指標(biāo)與測(cè)試方法

1.4.1 紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白

采用日本光電工業(yè)株式會(huì)社全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（MEK-7222K，Japan）測(cè)試血常規(guī)，選取紅細(xì)胞壓積（hematocrit，Hct）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）進(jìn)行研究。相關(guān)試劑由上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司提供。

1.4.2 腎臟水通道蛋白AQP2 mRNA表達(dá)

采用熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)。取適量腎臟放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP 管中；用Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司）試劑抽提總RNA；用DNaseI 消化樣品RNA 中的DNA；RNA 瓊脂糖凝膠電泳；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；加入依據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物（見(jiàn)表3），加入EvaGreen 核酸染料Mix，以cDNA 為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche LightCycler?480II）中進(jìn)行Real Time-PCR 檢測(cè)。分析產(chǎn)物溶解曲線并驗(yàn)證目標(biāo)基因AQP2 和內(nèi)參基因GAPDH 的擴(kuò)增效率是否接近100%；根據(jù)各反應(yīng)孔的目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的△CT值，運(yùn)用2-△△CT相對(duì)定量法計(jì)算目標(biāo)基因AQP2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 腎臟水通道蛋白AQP2蛋白表達(dá)

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

（1）蛋白抽提：預(yù)冷RIPA 蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；4℃離心（12000 rpm×15 min）。取上清液。（2）BCA法蛋白定量：按照BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)）使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。（3）Western Blot實(shí)驗(yàn)：取待檢測(cè)蛋白樣品進(jìn)行電泳分離（濃縮膠恒壓電泳：90 V，約20 min；分離膠恒壓150 V，通過(guò)預(yù)染蛋白marker 來(lái)確定電泳停止時(shí)間）。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，100 V 恒壓，60 min。將膜浸沒(méi)于5%BSA-TBST 中，水平搖床孵育1 h（RT）。一抗孵育：5%BSA-TBST 稀釋一抗（AQP2，1∶500；GAPDH，1∶1000，Abcam公司），4℃水平搖床孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜：3×10min。二抗孵育：5%BSATBST 稀釋二抗（山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1∶10000，Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗膜：3×10 min。將ECL發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3～5 min。膠片曝光：10 s～5 min，顯影2 min，定影。（4）計(jì)算結(jié)果：采用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用非參數(shù)檢驗(yàn)（獨(dú)立樣本Mann-Whitney U檢驗(yàn)）進(jìn)行組間比較。采用非參數(shù)檢驗(yàn)（相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 帶符號(hào)秩檢驗(yàn)）對(duì)高溫運(yùn)動(dòng)各組大鼠運(yùn)動(dòng)前與運(yùn)動(dòng)后直腸溫度進(jìn)行組內(nèi)比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重與運(yùn)動(dòng)時(shí)間

高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1A。進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的5組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1B。

2.2 大鼠體溫及冷卻速率

表3顯示，在高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)前，與C組相比，E組大鼠體溫顯著升高（P＜0.05）；但是進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的5組大鼠體溫相互間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示適應(yīng)性訓(xùn)練也會(huì)引起大鼠體溫上升。

與運(yùn)動(dòng)前相比，E組、EC2組、ER1組與ER2組大鼠體溫在高溫運(yùn)動(dòng)后升高（P＜0.05，P＜0.01）；EC1 組大鼠運(yùn)動(dòng)后體溫升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠的體重與運(yùn)動(dòng)時(shí)間

冷浸5 min 后，與ER1 組相比，EC1 組大鼠體溫降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，冷浸5 min 后的EC2 組大鼠體溫降低（P＜0.01），休息60 min 后的EC2 組大鼠體溫降低（P＜0.05）。與ER1 組相比，EC1 組大鼠冷卻速率降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠冷卻速率降低（P＜0.01）。參加冷浸的EC1組和EC2組大鼠冷卻速率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 大鼠紅細(xì)胞壓積與血紅蛋白

對(duì)各組大鼠的紅細(xì)胞壓積與血紅蛋白進(jìn)行分析，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，與C組相比，E組大鼠紅細(xì)胞壓積升高（P＜0.05），血紅蛋白雖有升高，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與E組相比，ER1組、EC1組、ER2組、EC2組大鼠紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與ER1 組相比，EC1 組大鼠紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 大鼠腎臟AQP2 mRNA表達(dá)

RNA 電泳圖顯示：提取的總RNA，經(jīng)甲醛變性膠電泳觀察，28S、18S、5S 三條帶清晰易辨，可以證實(shí)RNA 的完整性，樣品未發(fā)生降解，可以用于下游實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2A。PCR 引物檢測(cè)電泳圖顯示：根據(jù)電泳圖中RNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度大小與設(shè)計(jì)相符合；同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)引物擴(kuò)增序列與目的基因匹配；說(shuō)明引物可以用于熒光定量實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2B。PCR 擴(kuò)增曲線是樣品PCR 反應(yīng)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度的反映，呈S 型，復(fù)孔的CT 值接近一致；反應(yīng)完成后儀器會(huì)根據(jù)擴(kuò)增曲線給出樣品反應(yīng)的CT值，用于相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，見(jiàn)圖2C。PCR溶解曲線呈單峰，可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物單一，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常可用，見(jiàn)圖2D。

表3 各組大鼠的體溫(℃)及冷卻速率（℃∕min）

表4 各組大鼠的紅細(xì)胞壓積與血紅蛋白

與C 組相比，E 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與E組相比，常溫休息ER1組和ER2組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）；與休息ER1 組相比，冷浸EC1 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2E。

圖2 RNA電泳和PCR結(jié)果

2.5 大鼠腎臟AQP2蛋白表達(dá)

圖3顯示，與C組相比，E組大鼠腎臟AQP2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與E 組相比，常溫休息ER1 組和ER2組大鼠腎臟AQP2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠腎臟AQP2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與ER1 組相比，EC1 組大鼠腎臟AQP2 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與ER2 組相比，EC2 組大鼠腎臟AQP2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 Western Blot結(jié)果

3 討論

3.1 大鼠體溫變化

熱射病動(dòng)物模型分為兩大類：（1）在高溫環(huán)境下進(jìn)行熱暴露建立的熱射病動(dòng)物模型稱為經(jīng)典型熱射病動(dòng)物模型；（2）在高溫環(huán)境下進(jìn)行熱運(yùn)動(dòng)建立的熱射病動(dòng)物模型稱為勞力性熱射病動(dòng)物模型。

在實(shí)驗(yàn)室勞力性熱射病動(dòng)物模型的研究中，Zhang等以45℃高溫環(huán)境下熱運(yùn)動(dòng)至力竭作為熱射病診斷標(biāo)準(zhǔn)，建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對(duì)線粒體的保護(hù)作用，大鼠在建模前并未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練[16]。為了研究勞力性與經(jīng)典型熱射病大鼠模型體溫調(diào)節(jié)差異及預(yù)后特征，帥軍等安排大鼠在39℃高溫環(huán)境中運(yùn)動(dòng)，并以核心溫度升高到42℃作為熱射病診斷標(biāo)準(zhǔn)，建立了勞力性熱射病大鼠模型，所有大鼠均進(jìn)行6 天適應(yīng)性遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練后再進(jìn)行分組，適應(yīng)性訓(xùn)練是否會(huì)引起大鼠體溫變化未見(jiàn)報(bào)道[17]。

與前人的研究結(jié)果有所不同，本研究中的常溫對(duì)照組未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，但是5 個(gè)高溫運(yùn)動(dòng)組均進(jìn)行了適應(yīng)性訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示適應(yīng)性訓(xùn)練也會(huì)引起大鼠體溫上升。本研究中，在36℃高溫環(huán)境下熱運(yùn)動(dòng)至力竭的5組大鼠在運(yùn)動(dòng)后體溫均上升到42.0℃左右，符合勞力性熱射病大鼠建模標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明勞力性熱射病大鼠建模成功。

快速降溫是熱射病救治的關(guān)鍵。McDermott 等的研究認(rèn)為，在諸多降溫措施中，冷水浸泡的冷卻速率最快，研究發(fā)現(xiàn)2℃冷水浸泡時(shí)冷卻速率是0.35℃∕min，8℃和20℃冷水浸泡時(shí)冷卻速率均為0.19℃∕min。另外一些冷卻策略，如冷卻水霧噴灑、冷卻液體靜脈注射、冰敷外周動(dòng)脈等，由于冷卻速率過(guò)低而不建議采用[13]。在冷卻治療時(shí)間的設(shè)置上，Stewart 等的研究認(rèn)為勞力性熱射病患者通常具有41.0℃～43.5℃的核心體溫以及38.9℃的冷卻終止點(diǎn)體溫，依據(jù)每5 min 降低1℃的冷卻速率，提出冷水浸泡15 min或者提供合理的冷卻終止點(diǎn)進(jìn)行冷卻治療[15]。冷水浸泡時(shí)的冷卻速率存在運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目差異。Godek等的研究表明，越野賽運(yùn)動(dòng)員在10℃冷水浸泡時(shí)的冷卻速率為0.255℃∕min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃僅需要7.7 min；足球運(yùn)動(dòng)員的冷卻速率0.156℃∕min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃需要11.4 min[18]。本研究中兩組大鼠冷水浸泡時(shí)冷卻速率分別為1.15℃∕min 和1.10℃∕min，比人體降溫速率更快。兩組大鼠冷浸5 min 后體溫均降到低于運(yùn)動(dòng)前體溫，說(shuō)明冷浸5 min 對(duì)勞力性熱射病大鼠體溫已產(chǎn)生顯著影響。與人體相比，大鼠在冷浸時(shí)的冷卻速率更快，冷浸時(shí)間更短，提示物種或體重差異可能會(huì)產(chǎn)生不同的熱調(diào)節(jié)反應(yīng)。

3.2 大鼠血液濃縮程度

血常規(guī)檢查中紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白是反映血液濃縮程度的重要指標(biāo)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)大量出汗會(huì)引起機(jī)體脫水，血液濃縮，紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白升高。全軍重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)于2015年制定熱射病規(guī)范化診斷與治療專家共識(shí)（草案），提出勞力性熱射病發(fā)病早期因脫水致血液濃縮可出現(xiàn)血紅蛋白（Hb）升高、紅細(xì)胞壓積（Hct）增加、血小板（PLT）發(fā)病初期正常繼而迅速下降等血常規(guī)異常癥狀[19]。與前人的研究相一致，本研究中E組大鼠紅細(xì)胞壓積顯著高于C組大鼠，說(shuō)明大鼠進(jìn)行高溫運(yùn)動(dòng)確實(shí)會(huì)因?yàn)槊撍饳C(jī)體血液濃縮。與C 組大鼠相比，E 組大鼠血紅蛋白濃度雖然升高，但差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血紅蛋白在反映血液濃縮程度方面不夠敏感或可能存在滯后現(xiàn)象。本研究中，E組大鼠紅細(xì)胞壓積顯著性升高，提示紅細(xì)胞壓積是血液濃縮程度的敏感指標(biāo)，可作為勞力性熱射病發(fā)病的病理生理學(xué)標(biāo)志物。

在針對(duì)勞力性熱射病從運(yùn)動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)到急診部的處理流程中，Riana提出在運(yùn)動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行冷水浸泡是熱射病患者救治的首選方案；隨后應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，包括鈉（Na）、鉀（K）、氯（Cl）、葡萄糖（Gluc）、肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）和紅細(xì)胞壓積（Hct）等；治療脫水、低血糖和低鈉血癥等[14]。關(guān)于冷卻對(duì)血液濃縮程度影響的研究鮮有報(bào)道。在研究大鼠血液粘度對(duì)溫度的依賴性時(shí)，Lipina等發(fā)現(xiàn)冷卻會(huì)使大鼠血液濃縮，紅細(xì)胞壓積升高[20]。與Lipina等的研究有所不同，本研究中冷浸雖然引起大鼠紅細(xì)胞壓積及血紅蛋白下降，但并未發(fā)生顯著性變化，提示紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白對(duì)冷水浸泡帶來(lái)的溫度變化不夠敏感或可能存在滯后現(xiàn)象。引起紅細(xì)胞壓積改變的根本原因是脫水，而不是溫度。冷浸對(duì)紅細(xì)胞壓積沒(méi)有明顯影響，其原因可能是冷卻速率過(guò)快及冷浸時(shí)間較短（只有5 min），以至于機(jī)體的生化過(guò)程來(lái)不及作出反應(yīng)，未能明顯加重脫水（利尿途徑）或緩解脫水（抗利尿途徑），因而未能引起紅細(xì)胞壓積發(fā)生顯著性變化。

3.3 勞力性熱射病大鼠冷卻治療中水通道蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制探討

Hasegawa 等的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)時(shí)水分丟失是引起體溫升高的重要因素[21]。機(jī)體水代謝主要在腎臟由水通道蛋白進(jìn)行調(diào)控。AQPs 是一類具有跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白質(zhì)家族。目前在腎臟組織共發(fā)現(xiàn)了8 種AQPs，其中AQP1-4 在調(diào)節(jié)水轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用[22]。AQP2主要分布于集合管頂端質(zhì)膜，是響應(yīng)抗利尿激素（亦稱精氨酸加壓素，AVP）調(diào)節(jié)集合管對(duì)水通透性的主要靶分子，在維持水平衡中起重要作用。

為了探索高溫環(huán)境下力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腎臟水通道蛋白AQP2 的影響，董柔等進(jìn)行了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)在38℃環(huán)境下以20 m∕min 的速度運(yùn)動(dòng)至力竭的大鼠AQP2 mRNA 表達(dá)非常顯著性上調(diào)，AQP2 蛋白表達(dá)上調(diào)，但未引起顯著性變化。該研究認(rèn)為高溫力竭運(yùn)動(dòng)可通過(guò)上調(diào)AQP2 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)腎臟對(duì)水的重吸收，AQP2蛋白表達(dá)上調(diào)不顯著，可能與AQP2蛋白表達(dá)滯后于AQP2 mRNA 表達(dá)有關(guān)[23]。但該研究并未涉及熱射病對(duì)AQP2 mRNA表達(dá)及AQP2蛋白表達(dá)的影響。

水通道蛋白與人類健康密不可分，是疾病的特殊標(biāo)志物。據(jù)報(bào)道，在包括心力衰竭和肝硬化在內(nèi)的各種水排泄受損的疾病中，AQP2 在腎臟的含量會(huì)改變，AQP2的尿排泄增加[24]。熱射病實(shí)驗(yàn)室檢查中，有關(guān)水通道蛋白的研究并不常見(jiàn)。Du 等研究了熱射病尸檢人腦標(biāo)本中大腦皮層基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、緊 密 連 接 蛋 白（claudin5，CLDN5）、封閉蛋白（occludin，OCLN）、閉鎖小帶蛋白（zona occludens protein-1，ZO1）和水通道蛋白（aquaporins，AQPs）表達(dá)增加與熱射病腦水腫的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)熱射病患者M(jìn)MP9 mRNA、OCLN mRNA、ZO1 mRNA、CLDN5 mRNA、AQP4 mRNA顯著性升高，且與腦含水量增加呈正相關(guān)，但并未進(jìn)行AQP2的研究[25]。

水通道蛋白調(diào)節(jié)機(jī)體水代謝。熱射病誘導(dǎo)的腸道通透性改變可能與水通道蛋白對(duì)機(jī)體水代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。Wang 等研究了包括AQP2 在內(nèi)的10 種水通道蛋白在熱射病大鼠小腸組織中不同恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)熱射病發(fā)作時(shí)AQP7、AQP8 和AQP11 mRNA表達(dá)顯著性上調(diào)，熱射病后恢復(fù)1小時(shí)AQP1、AQP3和AQP5 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，提出熱射病誘導(dǎo)小腸損傷和細(xì)胞凋亡與AQPs 上調(diào)∕下調(diào)時(shí)水轉(zhuǎn)運(yùn)改變密切相關(guān)，但此研究中并未在小腸檢測(cè)到包括AQP2、AQP4、AQP6和AQP9在內(nèi)的4支基因的mRNA表達(dá)[26]。

與前人的研究有所不同，本研究主要聚焦在腎臟集合管水代謝。本研究中熱射病大鼠（E組）與常溫對(duì)照組（C 組）相比，水通道蛋白AQP2 mRNA 表達(dá)和AQP2蛋白表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.01），說(shuō)明高溫運(yùn)動(dòng)引起勞力性熱射病的同時(shí)導(dǎo)致AQP2合成顯著性增加，機(jī)體對(duì)水分的重吸收增強(qiáng)，以對(duì)抗機(jī)體的脫水情況。提示AQP2 mRNA 表達(dá)和AQP2 蛋白表達(dá)是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)，可作為勞力性熱射病發(fā)病的病理生理學(xué)標(biāo)志物。

有關(guān)低溫對(duì)水通道蛋白影響的研究很少報(bào)道。水通道蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜間微妙的滲透平衡，滲透損傷是冷凍過(guò)程中引起細(xì)胞死亡的主要因素。水通道蛋白AQP2 上調(diào)和轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)減輕低溫冷藏過(guò)程中冷誘導(dǎo)滲透損傷。Wang 等的研究表明，在冷凍前用抗利尿激素（AVP）處理大鼠腎髓質(zhì)集合管（inner medullar collecting duct，IMCD）細(xì)胞，使集合管細(xì)胞外質(zhì)膜上的AQP2 含量增加，可以減弱冷誘導(dǎo)（－4℃）引起的大鼠腎髓質(zhì)集合管細(xì)胞滲透損傷[27]。本研究中，經(jīng)過(guò)冷浸的EC1 組和EC2 組大鼠與E 組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)非常顯著性下調(diào)；AQP2 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。EC1組大鼠與ER1組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA表達(dá)非常顯著性下調(diào)；AQP2 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。EC2組大鼠與ER2組大鼠相比，腎臟AQP2 mRNA表達(dá)顯著性下調(diào)；AQP2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。這種現(xiàn)象說(shuō)明冷浸對(duì)腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)的影響最顯著，對(duì)AQP2蛋白表達(dá)的影響次之；進(jìn)一步證明冷浸影響腎臟水通道蛋白的合成，且這種影響符合從腎臟AQP2 mRNA表達(dá)到AQP2蛋白表達(dá)的逐級(jí)滯后的合成順序；腎臟AQP2 mRNA 表達(dá)和AQP2 蛋白表達(dá)對(duì)冷浸帶來(lái)的溫度變化敏感，其機(jī)制可能與AQP2在低溫下通過(guò)抑制抗脫水機(jī)制重建自身體溫調(diào)節(jié)有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究進(jìn)行證明。

4 結(jié)論

冷浸可以有效降低熱射病大鼠機(jī)體核心溫度；冷浸誘導(dǎo)水通道蛋白AQP2 mRNA 表達(dá)及AQP2 蛋白表達(dá)顯著性下調(diào)，導(dǎo)致水通道蛋白在腎臟的合成減弱；冷浸對(duì)紅細(xì)胞壓積Hct及血紅蛋白Hb沒(méi)有明顯影響。