李 瀅 劉 芳 馮 利 陳 雙

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的頭頸部腫瘤。甲狀腺癌的病理類型包括乳頭狀癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的惡性腫瘤，占甲狀腺癌的70%左右[1]。盡管多數(shù)患者預(yù)后良好，但是仍有一部分PTC 出現(xiàn)高侵襲、早期轉(zhuǎn)移[2]。因此，開展PTC 相關(guān)分子標(biāo)志物的研究，為臨床早期診斷和治療預(yù)后提供新的方法一直是臨床上的研究熱點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為，由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，累及周圍組織器官或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個及其復(fù)雜的基因變化[3]。微小RNA-129（miR-129）是一種內(nèi)源性單鏈非編碼的小RNA 分子，有調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增生和凋亡的作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-129 在結(jié)直腸癌、前列腺癌等中呈低表達(dá)[5-6]。本研究旨在分析miR-129 在PTC 組織表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010 年11 月—2014 年2 月浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）路橋醫(yī)院收治的PTC 患者125 例作為研究對象，其中男32 例、女93例，年齡20～75 歲，平均（40.36±8.42）歲。病理分級和臨床TNM 分期參照國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標(biāo)準(zhǔn)[7]：1 級77 例、2 級48 例；臨床TNM 分期：Ⅰ期24 例、Ⅱ期51 例、Ⅲ期35 例、Ⅳ期15 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過?；颊呔獣员狙芯績?nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）均符合國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標(biāo)準(zhǔn)；（2）均進(jìn)行全甲狀腺切除+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃；（3）均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）有嚴(yán)重肝腎功能不全者；（2）合并其他惡性腫瘤者；（3）入院前經(jīng)過放療或化療等治療者；（4）臨床及隨訪資料不完整者。

1.4 標(biāo)本采集 選取125 例PTC 并行手術(shù)治療患者，收集PTC 癌變組織125 份作為研究組，另在手術(shù)過程中收集125 份距離癌組織邊緣5cm 以上正常甲狀腺組織為對照組，兩組組織標(biāo)本均進(jìn)行miR-129水平的檢測。

1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組織miR-129mRNA 表達(dá) 采用TRIzol[賽墨飛世爾科技（中國）有限公司，批號ab49534]提取0.3g 甲狀腺癌組織及癌旁組織總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒（美國Life Technologies 公司，批號C120835）產(chǎn)生第一鏈互補(bǔ)（c）DNA。使用GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（GAPDH 正向引物5'-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3'；反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。PCR 引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供并合成，序列如下：miR-182 正向引物：5'-CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3'，反向引物：5'-CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。具體操作：將2μL RNA 與1μloligo（dT）和10μL 無RNase 的去離子水混合，在PCR 機(jī)中在70℃下孵育5min 并立即在冰上冷卻。通過加入4μL 5X 緩沖液，2μL 10mM 脫氧核糖核苷酸三磷酸，1μL RNA 抑制劑和1μL 逆轉(zhuǎn)錄酶誘導(dǎo)cDNA 合成，然后在PCR 機(jī)中于42℃溫育1h。通過在70℃溫育5min 終止反應(yīng)。使用THUNDERBIRDS YBR qPCR Mix 試劑盒（日本Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan公司，批號6514）進(jìn)行定量測量。對于PCR，將12.5μL 2XqPCR Mix，2.0μL 每 種 引 物（2.5μM），2.0μL cDNA 和8.5μL 雙蒸水加入0.2mL PCR 管中。擴(kuò)增條件包括40 個循環(huán)，95℃，15min，95℃，15s，55℃，30s，72℃，25s。然后將反應(yīng)保持在4℃。使用閾值循環(huán)（Ct）的值確定每個靶基因的mRNA 表達(dá)。在與GAPDH 比較后使用2-ΔΔCT 方法計(jì)算相對表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組間采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 法估計(jì)不同臨床特征PTC 患者的生存情況，通過非條件單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響PTC 患者預(yù)后的相關(guān)因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織標(biāo)本miR-129mRNA 表達(dá)水平比較PTC 患者其PTC 癌變組織miR-129 mRNA 表達(dá)水平低于癌旁正常組織[（0.66±0.21）比（1.89±0.48），P＜0.01]。

2.2 不同臨床特征PTC 患者甲狀腺癌組織miR-129 表達(dá)比較 根據(jù)ROC 曲線取miR-129 mRNA=0.49 時(shí)，約登指數(shù)最大為0.38。因此，miR-129 mRNA=0.49 時(shí)作為診斷PTC 的截點(diǎn)，miR-129 低表達(dá)患者（≤0.49）33 例（26.40%），miR-129 高表達(dá)患者（＞0.49）92 例（73.60%）。miR-129 的表達(dá)與PTC 患者其年齡、性別、腫瘤大小情況均無明顯關(guān)系（P＞0.05），miR-129 的表達(dá)與PTC 患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級的表達(dá)有顯著關(guān)系（P＜0.001、P＜0.001、P=0.018），見表1。

表1 不同臨床特征的PTC 患者其miR-129 表達(dá)情況比較[例（%）]

2.3 PTC 患者預(yù)后生存情況 本研究125 例PTC患者中，自出院后至隨訪結(jié)束存活4～60 個月，5 年生存率50.40%（63/125）。其中miR-129 高表達(dá)和低表達(dá)患者5 年總生存率分別為72.73%（24/33）和42.39%（39/92），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 影響PTC 患者預(yù)后的單因素分析 經(jīng)單因素分析得出：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達(dá)時(shí)患者生存時(shí)間均顯著縮短（P＜0.05），見表2。

2.5 影響PTC 患者預(yù)后Cox 多因素分析 經(jīng)多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析得出：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達(dá)均為影響PTC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001），見表3。

3 討論

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞因子和基因的表達(dá)與患者治療及預(yù)后情況密切相關(guān)[8]，故尋找影響患者病情進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)因素是改善PTC 患者預(yù)后的關(guān)鍵。miRNA是一類長度為20～24nt 的單鏈非編碼微小RNA，廣泛存在于動植物中。腫瘤細(xì)胞組織miRNA 基因的改變存在多樣化，主要以基因缺失、過表達(dá)及基因擴(kuò)增為主[9]。研究表明，miRNA 在細(xì)胞或組織中可充當(dāng)抑癌基因或者促癌基因的角色，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。相關(guān)研究證實(shí)，miR-34、miR-1301、miR-19等在PTC 異常表達(dá)，對PTC 患者造成嚴(yán)重影響[11-12]。

表2 影響PTC 患者預(yù)后的單因素分析

本組研究中，PTC 癌變組織miR-129 表達(dá)低于癌旁正常組織，患者臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級越高其miR-129 低表達(dá)率明顯升高，這提示miR-129 在機(jī)體中的表達(dá)與PTC 的發(fā)生和疾病進(jìn)展有密切關(guān)系。于浩等[13]研究表明，miR-129 在膀胱癌組織呈低表達(dá)水平，且支持miR-129 可能成為膀胱癌診斷的無創(chuàng)腫瘤標(biāo)記物，可用于早期診斷及預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)的預(yù)測。潘印等[14]研究顯示，在前列腺癌患者，miR-129 在腫瘤低分化、病理分期越高中呈低表達(dá)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)miR-129 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。多因素Cox 回歸分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級2 級及miR-129 低表達(dá)均為PTC 患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。既往研究表明，張力蛋白同源的基因、人類第10 號染色體缺失的磷酸酶及程序性細(xì)胞死亡因子4、肌球蛋白1 等在惡性腫瘤形成過程中起重要作用的抑癌基因，均為miR-129 的下游靶基因，通過調(diào)控這些下游靶基因，進(jìn)而調(diào)控這些因子所在的信號傳導(dǎo)通路，從而在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起促進(jìn)作用[15]。由此可見，miR-129 在PTC 患者疾病的發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后中有著重要的影響，因此，miR-129 可作為判斷甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及預(yù)后的生物標(biāo)志物，臨床上檢測miR-129 表達(dá)水平，預(yù)測PTC 患者的預(yù)后情況。

表3 影響PTC 患者預(yù)后Cox 多因素分析

綜上所述，在PTC 癌組織miR-129 以較低水平表達(dá)，隨患者臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級越高時(shí)其表達(dá)率均上升。miR-129 表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展程度和惡性程度呈負(fù)相關(guān)，miR-129 低表達(dá)PTC患者預(yù)后相對較差，檢測miR-129 表達(dá)水平有利于PTC 的診斷及預(yù)后評價(jià)。但本組研究所選樣本量較少及研究及隨訪時(shí)間過短，對于miR-129 的表達(dá)是否受其他因素影響尚未明確，需進(jìn)一步深入研究。