裴芳藝 姜 明 馬巖石 陳 雪 劉振艷 劉 溪 陳曉婷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處衛(wèi)生檢驗(yàn)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

酵母菌是人類文明史上利用最早的微生物，為兼性厭氧菌，其中屬釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)利用得最為普遍[1]。S.cerevisiae又稱面包酵母或者出芽酵母，是一種公認(rèn)的與人類關(guān)系最廣泛的GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物，廣泛用于制作面包和饅頭等食品，在工業(yè)生產(chǎn)中，主要應(yīng)用于發(fā)酵谷類釀造酒類[2-4]。

不同的S.cerevisiae種因其獨(dú)特的代謝方式直接影響發(fā)酵過程中有機(jī)酸的分泌，而有機(jī)酸是發(fā)酵食品中酸味的重要組成部分，與發(fā)酵食品的質(zhì)量評價和品質(zhì)管理有著密切的關(guān)系[5-6]。對酸味起主要作用的有機(jī)酸為檸檬酸、乳酸、乙酸等[7]，其中檸檬酸有清爽宜人的味道，給人一種持續(xù)的味覺刺激，檸檬酸含量越高，風(fēng)味越好[8]?？偹岷科?，會出現(xiàn)口感粗糙、不協(xié)調(diào)；總酸含量偏低則會出現(xiàn)口感黏稠、不爽口；適宜的總酸，能夠賦予釀造食品尤其是酒精飲料的平衡協(xié)調(diào)、柔和清爽、活潑的口感[9-10]。由于有機(jī)酸種類、含量及其比例關(guān)系對釀造食品的風(fēng)味、pH值等都有重要的影響[11]。目前對于發(fā)酵食品中有機(jī)酸的研究主要集中在乳酸菌等益生菌上[12]，并未對S.cerevisiae發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化進(jìn)行研究。此外，當(dāng)前的研究焦點(diǎn)是利用基因工程手段提高乙醇[13]、2,3-丁二醇等醇類物質(zhì)產(chǎn)量[14]，忽略了酵母菌有機(jī)酸代謝途徑的研究，及其在食品、酒精飲料中的作用。

有機(jī)酸及代謝產(chǎn)物的分析方法有氣相色譜法(Gas chromatography, GC)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)及核磁共振法(Nuclear magnetic resonance, NMR)。其中，GC法在揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的研究方面具有一定的優(yōu)勢，然而操作過程中需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，使得產(chǎn)物大量損失。NMR由于價格昂貴，分析較復(fù)雜，在常規(guī)檢測中應(yīng)用較少。HPLC因其操作簡便，檢測靈敏，是目前有機(jī)酸及食品風(fēng)味物質(zhì)研究的主要手段。因此，試驗(yàn)擬利用HPLC對3株S.cerevisiae發(fā)酵過程中葡萄糖、甘油、乙醇及有機(jī)酸含量進(jìn)行測定分析，力求找尋能夠提高食品、酒類產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的優(yōu)勢菌株，為酵母菌代謝途徑研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

S.cerevisiae1946(CICC 1946)、S.cerevisiae32788(CICC 32788)：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；

S.cerevisiaeP1：實(shí)驗(yàn)室自行分離。

1.1.2 試劑

硫酸：色譜純，天津科密歐有限公司；

無水檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、L-乳酸、甲酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)(貨號HB5193)、YPD液體培養(yǎng)基(貨號HB5193-1)：青島海博生物技術(shù)有限公司。

葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g，酵母提取物5 g，(NH4)2SO42.5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，無水CaCl20.25 g，蒸餾水1 L，調(diào)pH至5.0，108 ℃ 高壓濕熱滅菌20 min，用于S.cerevisiae發(fā)酵培養(yǎng)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：WatersTMe2695型，美國Waters公司；

高速離心機(jī)：5804R型，上海艾研生物科技有限公司；

生化培養(yǎng)箱：BSP-400型，上海博訊有限公司；

往復(fù)式恒溫震蕩水域培養(yǎng)搖床：SPH-110X12型，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將甘油管保藏的菌株S.cerevisiae1946、S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1分別接種于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，活化菌株。將活化后的菌液分別三區(qū)劃線于YPD固體平板上，30 ℃、靜置培養(yǎng)48 h。連續(xù)傳代培養(yǎng)3代后，挑取生長狀況優(yōu)良的單菌落分別接種于100 mL/250 mL YPD液體培養(yǎng)基中，制備種子液。

1.2.2 制備發(fā)酵液 將種子液以5 mL/100 mL的接種量接種于葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)60 h，每隔6 h取適量發(fā)酵液，待測。

1.2.3 高效液相色譜分析 AminexHPX-87H有機(jī)酸分析柱(300 mm×7.8 mm；Bio-Rad；Hercules)。流動相：0.005 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm。配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 g/L)，取稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，13 000 r/min 離心10 min后取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL/針，測定得到相應(yīng)濃度的峰面積與出峰時間，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取發(fā)酵液1 mL進(jìn)行梯度稀釋100倍，13 000 r/min離心10 min后取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL/針，根據(jù)各組分出峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著水平設(shè)定為0.05。利用JMP(Version 9.0.2，SAS，Inc)軟件進(jìn)行方差分析及多重比較，并用Sigmaplot(Version 10.0，Systat Software，Inc)軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分析及回歸方程

通過HPLC色譜圖可知標(biāo)準(zhǔn)品出峰效果良好，按照出峰時間順序依次為檸檬酸(7.6 min)、α-酮戊二酸(8.0 min)、葡萄糖(8.6 min)、丙酮酸(9.0 min)、蘋果酸(10.9 min)、琥珀酸(11.4 min)、L-乳酸(12.0 min)、甘油(12.9 min)、甲酸(13.4 min)、乙酸(14.6 min)、乙醇(21.4 min)。以進(jìn)樣量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(mAU·min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程，如表1所示。由表1可知，相關(guān)系數(shù)符合試驗(yàn)預(yù)期要求(R2>0.99)，表明該色譜工作條件測定性能穩(wěn)定、重現(xiàn)性高。

表1 各種試劑的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 葡萄糖、甘油和乙醇含量變化

2.2.1 葡萄糖 由圖1可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行葡萄糖被不斷消耗，在發(fā)酵12 h時，葡萄糖均被消耗殆盡。在發(fā)酵6 h時，3種發(fā)酵體系中葡萄糖的剩余量分別為(10.01±2.50)(S.cerevisiaeP1)，(5.73±0.71)(S.cerevisiae1946)，(8.54±0.93)(S.cerevisiae32788) g/L，S.cerevisiae1946對葡萄糖的利用速度大于S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1。

圖1 3株S. cerevisiae發(fā)酵體系中葡萄糖含量變化曲線

2.2.2 甘油 由圖2可知，隨著葡萄糖的不斷消耗，菌體大量繁殖，甘油呈現(xiàn)先急速上升后保持穩(wěn)定的趨勢。在整個發(fā)酵過程中(除發(fā)酵24 h外)，S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中甘油的含量顯著高于S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1發(fā)酵體系(P<0.05)，而S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1發(fā)酵體系中甘油的含量無顯著差異(P>0.05)。在發(fā)酵末期，3種發(fā)酵體系中甘油的含量分別為(3.25±0.14)(S.cerevisiaeP1)，(3.51±0.03)(S.cerevisiae1946)，(3.30±0.10)(S.cerevisiae32788) g/L。甘油作為中性代謝物質(zhì)在維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓均衡的基礎(chǔ)上，起到調(diào)節(jié)氧化還原的作用[15-16]。

2.2.3 乙醇 由圖3可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行乙醇的含量呈現(xiàn)先急速上升后略有下降最后保持平穩(wěn)的趨勢。在發(fā)酵24 h時，乙醇含量最高，在3個發(fā)酵體系中分別為(32.85±0.54)(S.cerevisiaeP1)，(35.82±0.67)(S.cerevisiae1946)，(32.00±2.64)(S.cerevisiae32788) g/L。從整個發(fā)酵過程來看，在S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中，乙醇的含量始終高于S.cerevisiae32788和S.cerevisiae1946發(fā)酵體系。在發(fā)酵末期，S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中乙醇的含量最高，為(29.88±1.28) g/L。相較于S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788，S.cerevisiae1946可以有效地將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇。

圖2 3株S. cerevisiae發(fā)酵體系中甘油含量變化曲線

圖3 3株S. cerevisiae發(fā)酵體系中乙醇含量變化曲線

綜上研究表明，酵母菌在發(fā)酵過程中將α-酮戊二酸、丙酮酸和乳酸逐漸轉(zhuǎn)化為乙醇代謝中間產(chǎn)物，隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇和甘油的濃度逐漸增加。在發(fā)酵后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，酵母菌生長代謝活性降低，導(dǎo)致甘油含量穩(wěn)定，乙醇含量略有減少[17]，與試驗(yàn)結(jié)果相符。然而，隨著乙醇發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中酒精度不斷增加，較高的酒精度會抑制酵母細(xì)胞的生長[18]。因此S.cerevisiae1946雖然可以有效地代謝葡萄糖產(chǎn)生乙醇，但其生長狀況不如S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788。

2.3 有機(jī)酸含量變化

2.3.1 有機(jī)酸總量 由圖4可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行有機(jī)酸含量呈現(xiàn)先升高后保持平穩(wěn)的趨勢，而在S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中，有機(jī)酸的含量上升較快，在前48 h 時，始終高于S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1發(fā)酵體系。發(fā)酵48 h后，S.cerevisiae1946體系中有機(jī)酸含量保持穩(wěn)定，而S.cerevisiae32788和S.cerevisiaeP1體系中有機(jī)酸含量繼續(xù)快速升高，在66 h時趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵末期，3種發(fā)酵體系中有機(jī)酸的含量分別為(4.05±0.02)(S.cerevisiaeP1)，(2.88±0.04)(S.cerevisiae1946)，(4.02±0.03)(S.cerevisiae32788) g/L。S.cerevisiae1946中有機(jī)酸的含量積累的速度大于S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788發(fā)酵體系，但在發(fā)酵末期有機(jī)酸含量較低。因此可以看出，S.cerevisiaeP1可以快速地利用葡萄糖產(chǎn)生甘油、有機(jī)酸，但與S.cere-visiae32788和S.cerevisiaeP1相比，S.cerevisiae1946轉(zhuǎn)化率較低，可能是菌株在生長代謝過程中，利用葡萄糖產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物。酸類物質(zhì)是酒精飲料中重要的風(fēng)味物質(zhì)，在酒精飲料中有增加濃厚感和減少甜味的作用，但酸含量要適中，否則會影響酒精飲料的口感和風(fēng)味[19]。

有機(jī)酸總量為每一發(fā)酵體系中各種有機(jī)酸的總量

2.3.2 各有機(jī)酸含量 由圖5可知，在整個發(fā)酵過程中，共檢測到7種有機(jī)酸。隨著發(fā)酵的進(jìn)行各有機(jī)酸含量不斷升高。發(fā)酵12 h時，在S.cerevisiaeP1中，琥珀酸含量最高，為(0.18±0.05) g/L，其次為丙酮酸[(0.15±0.04) g/L]；在S.cerevisiae1946中，乙酸的含量最高，為(0.52±0.01) g/L，其次為丙酮酸[(0.37±0.08) g/L]；在S.cerevisiae32788中，丙酮酸的含量最高，為(0.19±0.01) g/L，其次為琥珀酸[(0.14±0.03) g/L]。此時，S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中，無論是有機(jī)酸種類還是有機(jī)酸含量均與S.cerevisiae32788、S.cerevisiaeP1發(fā)酵體系不同。隨著發(fā)酵時間的延長，S.cerevisiae1946體系中有機(jī)酸種類減少，但有機(jī)酸含量逐漸升高。在S.cerevisiaeP1體系中，乙酸、丙酮酸、琥珀酸的含量顯著增加(P<0.05)，檸檬酸、甲酸含量不斷減少。而在S.cerevisiae32788體系中，除L-乳酸含量減少外，其余有機(jī)酸均呈不斷增長的趨勢。發(fā)酵72 h時，3個發(fā)酵體系中，乙酸含量最高，其次為丙酮酸；而在S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中未檢測到L-乳酸，故S.cerevisiae32788與S.cerevisiaeP1的代謝過程較為相似，不同于S.cerevisiae1946。琥珀酸是糖類和大部分氨基酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物[20]。在3個發(fā)酵體系中，琥珀酸的含量逐漸增加，發(fā)酵末期，仍保持較高水平。在S.cerevisiaeP1發(fā)酵前12 h檢測到低量檸檬酸，其余發(fā)酵體系均未檢測到檸檬酸，是由于S.cerevisiae在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的檸檬酸較少，且會被S.cerevisiae利用[21]。

綜上可知，S.cerevisiae32788與S.cerevisiaeP1能將丙酮酸轉(zhuǎn)換成乙酸，同時伴有L-乳酸的生成，而S.cerevisiae1946則將丙酮酸轉(zhuǎn)換成乙酸，并不產(chǎn)生乳酸。低產(chǎn)酸水平的酵母可促使更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙酸，減少乙醇產(chǎn)量，酵母菌的產(chǎn)酸水平與產(chǎn)乙醇能力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[18]。袁文杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵的主要產(chǎn)物為乙醇，主要副產(chǎn)物為乙酸、甘油和琥珀酸。乙酸是酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的伴生產(chǎn)物，其變化趨勢及含量與乙醇呈正向耦合。梁璋成等[22]研究結(jié)果表明，乳酸、乙酸和琥珀酸是發(fā)酵的主要產(chǎn)物，其含量均隨酒精發(fā)酵的進(jìn)行而增加。故3株S.cerevisiae的產(chǎn)酸能力與產(chǎn)乙醇能力一一對應(yīng)。

圖5 3株釀酒酵母發(fā)酵過程中不同有機(jī)酸的含量變化

3 結(jié)論

利用HPLC對3株S.cerevisiae發(fā)酵過程中葡萄糖、甘油、乙醇及有機(jī)酸含量進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明：S.cerevisiae1946發(fā)酵體系中甘油、乙醇的含量顯著高于S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788發(fā)酵體系(P<0.05)；S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788發(fā)酵體系中有機(jī)酸的含量顯著高于S.cerevisiae1946發(fā)酵體系(P<0.05)；3個發(fā)酵體系中，乙酸的含量最高，其次為丙酮酸，S.cerevisiae的產(chǎn)酸水平與產(chǎn)乙醇能力呈負(fù)相關(guān)。故菌株S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788具有應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的潛力。下一步應(yīng)重點(diǎn)研究S.cerevisiaeP1和S.cerevisiae32788在發(fā)酵過程中氨基酸及其他重要代謝產(chǎn)物的變化情況，并將菌株應(yīng)用于食品或釀酒發(fā)酵，探究其發(fā)酵功能。