李冰濤 章輝 肖思雨 翟興英 涂珺 張啟云 徐國良 邵峰 朱衛(wèi)豐 劉榮華

摘要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究葛根治療冠心病的作用機(jī)制。方法? 通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫收集葛根化學(xué)成分并對其進(jìn)行類藥性分析，預(yù)測作用靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò);通過CooLGeN檢索疾病相關(guān)基因，與葛根作用靶點(diǎn)做交叉分析，發(fā)現(xiàn)葛根治療靶點(diǎn)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析;最后進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析、通路富集分析。結(jié)果? 葛根的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含70個(gè)成分、180個(gè)相應(yīng)靶點(diǎn)，其中18個(gè)靶點(diǎn)為葛根治療冠心病的靶點(diǎn)。主要生物過程包括氮和氧的代謝與合成及脂肪酸代謝，主要通路包括血小板活化通路、花生四烯酸代謝通路、AGE/RAGE通路、一氧化氮作用通路等。結(jié)論? 葛根通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮對冠心病的治療作用，一氧化氮作用通路、AGE/RGAE通路、花生四烯酸通路等可能是葛根治療冠心病的主要通路。

關(guān)鍵詞：葛根;冠心病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);生物過程;通路分析

中圖分類號：R259.414;R285??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0096-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.021????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To study the molecular mechanism of coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix based on network pharmacology. Methods Chemical components of Puerariae Lobatae Radix were collected through chemical professional database and the drug-like properties were analyzed; the targets were predicted; a component-target network was constructed. Disease-related genes were retrieved by CooLGeN and were cross-analyzed with the targets of Puerariae Lobatae Radix; the therapeutic targets of Puerariae Lobatae Radix were found; protein interaction network analysis was performed. Finally， the enrichment analysis of GO biological process and pathway enrichment analysis were carried out. Results Component-target network of Puerariae Lobatae Radix contained 70 components and 180 corresponding targets， of which 18 targets were targets for the treatment of coronary heart disease. The main biological processes included the metabolism and synthesis of nitrogen and oxygen and fatty acid metabolism. The main pathways included platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， AGE/RAGE pathway， and nitric oxide pathway. Conclusion The therapeutic effect of Puerariae Lobatae Radix on coronary disease may be realized through a multi-targets and multi-pathways way， and platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， and AGE/RAGE pathway may play an important role in coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix.

Keywords： Puerariae Lobatae Radix; coronary disease; network pharmacology; biology process; pathway analysis

冠心病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化所致的管腔狹窄，冠狀動(dòng)脈供血相對不足，引起心肌缺血、缺氧的心臟疾病[1]，屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心悸”范疇。《金匱要略》認(rèn)為胸痹的病機(jī)為“陽微陰弦”。心氣不足，痰瘀互結(jié)，心氣虛無力推動(dòng)血液在脈道中運(yùn)行，則血行瘀滯而瘀阻心脈[2]。葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，性涼，味甘、辛，歸脾、胃、肺經(jīng)[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載葛根“主諸痹”，即可用于氣血痹阻不通之證。由于葛根成分復(fù)雜，且冠心病的發(fā)生發(fā)展涉及機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因和信號通路，單靶點(diǎn)、單藥物的研究方法不適合系統(tǒng)說明葛根治療冠心病的機(jī)制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過對葛根藥物-靶點(diǎn)-生物過程-途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系研究，從多成分、多通路作用角度闡述葛根治療冠心病的作用機(jī)制。

1? 資料與方法

1.1? 化學(xué)成分收集

基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem. csdb.cn）收集野葛化學(xué)成分，檢索日期為2018年8月1日。除去金屬元素與結(jié)構(gòu)正在更新的化學(xué)成分，通過PubMed Compound（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed）與Chemicalbook數(shù)據(jù)庫（https：//www. chemicalbook.com/）確認(rèn)分子結(jié)構(gòu)，下載并保存為sdf或mol格式文件，建立葛根成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2? 類藥性分析

化學(xué)成分通過吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程才能發(fā)揮藥效。藥物的吸收是藥物成藥的基礎(chǔ)，類藥性分析是評價(jià)吸收特性的基礎(chǔ)分析方法。根據(jù)Lipinski規(guī)則，當(dāng)氫鍵供體數(shù)目（連接在N和O上的氫原子數(shù)）>5、氫鍵受體數(shù)目（N和O的數(shù)目）>10、相對分子質(zhì)量>500、脂水分配系數(shù)ClogP>5或MlogP>4.15、化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量超過10個(gè)時(shí)，吸收或滲透效果較差的可能性更大[4]。利用SYBYL2.0軟件設(shè)計(jì)分子表單，計(jì)算相應(yīng)參數(shù)，以違背該規(guī)則2項(xiàng)以上為排除標(biāo)準(zhǔn)，從葛根成分?jǐn)?shù)據(jù)庫中篩選活性成分。

1.3? 藥物靶點(diǎn)預(yù)測

1.3.1? 葛根成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

基于Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www. swisstargetprediction.ch/），依據(jù)分子SMILES號查找相應(yīng)靶點(diǎn)，將其下載為csv格式并整理。為提高預(yù)測靶點(diǎn)的質(zhì)量，本研究以與葛根小分子交互作用概率>50%（Probability>0.5）的靶點(diǎn)作為有效靶點(diǎn)。利用Cytoscape3.2.1軟件建立可視化成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，各化合物與對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)代表蛋白或化合物，線代表蛋白與化合物的相關(guān)性[5]。

1.3.2? 藥物-疾病共同靶點(diǎn)分析

CooLGeN是在線文本挖掘工具，通過關(guān)鍵詞檢索檢索可以發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵詞相關(guān)的基因。本研究基于CooLGeN（http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php）收集疾病靶點(diǎn)，通過與葛根作用靶點(diǎn)交叉分析，得到葛根治療冠心病的可能作用靶點(diǎn)。為保證檢索疾病靶點(diǎn)的有效性，避免假陽性，研究過程中依據(jù)文獻(xiàn)影響因子和靶點(diǎn)基因頻率刪除部分文獻(xiàn)影響因子低且支持?jǐn)?shù)據(jù)較少的靶點(diǎn)基因。具體方法為：以冠心病的醫(yī)學(xué)主題詞“Coronary disease”為檢索詞，文獻(xiàn)影響因子（impact factor）為5～40，出版年限（publishing year）為1988～2018，靶點(diǎn)基因類型（input genes）為All human genes，基于文獻(xiàn)檢索冠心病的相關(guān)靶點(diǎn)基因，篩選基因頻率最高的80%基因?yàn)榧膊』颉Ｗ詈髮⒏鸶煞职悬c(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行分析。

1.3.3? 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

藥物對疾病的治療效應(yīng)是多個(gè)蛋白交互作用的結(jié)果。本研究使用在線交互作用工具GeneMANIA（http：//genemania.org/）構(gòu)建葛根治療冠心病的交互作用網(wǎng)絡(luò)。首先將葛根治療冠心病的可能作用蛋白轉(zhuǎn)化為基因名，導(dǎo)入GeneMANIA，物種選擇為人（Homo sapions），構(gòu)建蛋白質(zhì)交互作用關(guān)系，然后將蛋白質(zhì)交互關(guān)系以csv格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.2.1，可視化蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征（Degree）找出葛根治療冠心病的重要靶點(diǎn)。

1.3.4? 生物學(xué)過程與通路富集分析

將葛根治療冠心病交互作用蛋白導(dǎo)入ClueGO插件，分別進(jìn)行生物學(xué)過程（biology process）富集分析和通路（pathway）富集分析。通路富集分析數(shù)據(jù)庫選擇KEGG和wikipathway數(shù)據(jù)庫，P≥0.05，其余參數(shù)均為默認(rèn)值。

2? 結(jié)果

2.1? 葛根化學(xué)成分及類藥性分析

通過對下載成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，共得到葛根成分100個(gè)，主要為黃酮類成分。其中94個(gè)成分符合Linpinski類藥性原則，編號為M1～M94，見表1。

2.2? 葛根成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

葛根94個(gè)成分中，24個(gè)成分無有效靶點(diǎn)，其余70個(gè)成分共作用于180個(gè)靶點(diǎn)，依據(jù)其對應(yīng)關(guān)系構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見圖1）?？梢?，1種成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，1個(gè)靶點(diǎn)也聯(lián)系著多種成分，體現(xiàn)了葛根多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

2.3? 葛根治療冠心病的作用靶點(diǎn)分析

基于CooLGeN檢索得到冠心病相關(guān)基因508個(gè)。對冠心病相關(guān)基因及葛根作用靶點(diǎn)基因名稱進(jìn)行交叉分析，比對冠心病及葛根共同基因18個(gè)，分別為NOS3、NOS1、NOS2、ALPP、MPO、CDK1、MMP2、MMP3、ESR1、CYP19A1、FABP4、PTGS1、PTGS2、ALDH2、LDLR、MIF、TERT、CYP1A1。這些基因可能是葛根治療冠心病的作用靶點(diǎn)。

2.4? 靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將葛根治療冠心病的18個(gè)可能作用靶點(diǎn)以基因名稱導(dǎo)入GenMANIA，發(fā)現(xiàn)20個(gè)蛋白與葛根治療冠心病的靶點(diǎn)有交互作用，基于葛根作用靶點(diǎn)及交互作用的38個(gè)蛋白構(gòu)建的蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)見圖2?？梢钥闯?，在葛根治療冠心病蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)中，Degree值較高的前5個(gè)節(jié)點(diǎn)依次為CYP119A1（31）、NOS1（29）、CYP11A1（26）、NOS3（25）、NOS2（24），這些節(jié)點(diǎn)蛋白可能在葛根治療冠心病作用的過程中發(fā)揮重要作用。

2.5? 生物學(xué)過程富集分析

對蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)中的38個(gè)基因進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析，共獲得89條生物過程。以P<0.01為條件，前20條生物通路的注釋信息見表2。結(jié)果顯示，葛根治療冠心病的生物學(xué)過程主要為cGMP生物合成過程的正向調(diào)控、活性氧代謝過程、cGMP代謝過程的正向調(diào)節(jié)、cGMP生物合成過程、cGMP生物合成過程的調(diào)控、cGMP代謝過程、一氧化氮代謝過程、活性氮代謝過程、活性氧生物合成過程、一氧化氮生物合成過程、甾醇代謝過程、核苷酸代謝過程的正向調(diào)節(jié)、嘌呤核苷酸代謝過程的正向調(diào)節(jié)、長鏈脂肪酸代謝過程等。

2.6? 通路富集分析

對葛根治療冠心病交作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，共獲得32條通路，其中18條通路來源于KEGG數(shù)據(jù)庫，14條通路來源于Wiki Pathways數(shù)據(jù)庫，見圖3。這些通路包括花生四烯酸代謝通路、血小板活化通路、一氧化氮作用通路、AGE/RAGE通路、精氨酸生物合成通路、精氨酸與脯氨酸代謝通路、NF-κB信號通路、脂肪酸ω氧化通路、醛固酮合成與分泌通路、脂肪細(xì)胞脂解作用調(diào)節(jié)通路、前列腺素的合成與調(diào)控通路、雌激素受體通路、硫胺素代謝通路、葉酸生物合成通路、腎素分泌通路、唾液分泌通路、甾體激素生物合成通路、色氨酸代謝通路、細(xì)胞色素P450對外源化合物代謝影響、卵巢類固醇生成通路、維生素B12代謝通路、葉酸代謝通路、細(xì)胞色素P450氧化通路等。

3? 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用，這種現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究的哲學(xué)理念和研究模式與中醫(yī)整體觀念不謀而合，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了新的思路。探索中藥治療疾病的作用機(jī)制是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中醫(yī)藥研究中的主要應(yīng)用領(lǐng)域。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索葛根治療冠心病的機(jī)制。通過葛根治療冠心病的物質(zhì)基礎(chǔ)，構(gòu)建其治療冠心病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并富集了該生物學(xué)過程和代謝通路。結(jié)果顯示，葛根治療冠心病可能與cGMP、一氧化氮的生物合成、代謝，活性氧的生成，花生四烯酸代謝及脂肪酸氧化等相關(guān)，這些生物過程與葛根擴(kuò)張血管、降脂、抗炎、抗氧化等藥理作用一致。代謝通路中氨基酸、激素、酯類代謝和一氧化氮的作用通路等都與冠心病有關(guān)。精氨酸與脯氨酸代謝通路在冠心病心血瘀阻證的亞血瘀證期發(fā)揮了重要作用[6]?；ㄉ南┧岽x也與冠心病密切相關(guān)，血栓素A2和前列環(huán)素作為花生四烯酸代謝產(chǎn)物，二者之間的平衡失調(diào)會(huì)導(dǎo)致冠心病進(jìn)一步發(fā)展，甚至發(fā)生心肌梗死[7]。另外，AGE/RAGE通路與冠心病的發(fā)生也有著一定的關(guān)系，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在動(dòng)脈管壁中巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)外的沉積，與動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度有關(guān)。AGEs與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合會(huì)激活核因子-κB，分泌大量致炎性因子，造成血管內(nèi)皮損傷，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展，體外實(shí)驗(yàn)顯示葛根提取物能抑制AGEs形成[8-9]，AGE/RAGE通路可能是個(gè)葛根治療冠心病的重要通路。一氧化氮是一種信使分子，可舒張血管周圍的平滑肌細(xì)胞，使血管擴(kuò)張，增加心肌供血供氧，改善冠心病患者心肌缺血缺氧狀態(tài)。臨床研究顯示，葛根主要成分葛根素能顯著升高冠心病患者一氧化氮水平，有效改善心肌缺血[10]。血栓形成學(xué)說是冠心病的主要發(fā)病學(xué)說，活化的血小板暴露的磷脂內(nèi)膜可以促進(jìn)凝血過程發(fā)生和發(fā)展。葛根治療冠心病與其血小板活化作用相關(guān)[11]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步研究葛根治療冠心病機(jī)制，研究結(jié)果顯示富集分析獲取的生物過程與藥理效應(yīng)相符，相關(guān)代謝通路可能是葛根治療冠心病的機(jī)制。本研究結(jié)果可為后期實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)與參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王永剛，齊婧，鐘偉，等.冠心病中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)與探索[J].中醫(yī)雜志，2015，56（17）：1449-1452.

[2] 張苒，石磊.《金匱要略》“陽微陰弦”在冠心病心絞痛辨治中的指導(dǎo)意義[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（27）：3288-3289.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：333.

[4] LIPINSKI C A， LOMBARDO F， DOMINY B W， et al. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings 1[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2012，64（1/2/3）：4-17.

[5] 潘國鳳，羅然，呂文英，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)養(yǎng)陰清肺口服液對肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2018，34（1）：19-24.

[6] 劉培，肖隋熙，羅穎，等.心血瘀阻證動(dòng)態(tài)演變過程生物信息學(xué)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（2）：130-135.

[7] 楊魯渤，李光明，張慶成，等.冠心病患者血漿花生四烯酸代謝產(chǎn)物的臨床研究[J].醫(yī)學(xué)綜述，1997，3（11）：542-543.

[8] 喬愛敏，李樂，劉青.晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體RAGE在糖尿病血管并發(fā)癥中的作用機(jī)制[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（11）：1306- 1311.

[9] KIM J M， LEE Y M， LEE G Y， et al. Constituents of the roots of Pueraria lobata inhibit formation of advanced glycation end products （AGEs）[J]. Archives of Pharmacal Research，2006，29（10）：821-825.

[10] 徐波，張玲.葛根素對冠心病患者血漿內(nèi)皮素和一氧化氮水平及心肌缺血的療效探討[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2012，16（17）：37-39.

[11] 曾躍華，陳云龍.葛根素治療冠心病及對活化血小板的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（6）：997.

（收稿日期：2018-10-18）

（修回日期：2018-11-22;編輯：陳靜）