劉湘 喬麗菲 劉垚君 鄭范麗 張玉琴 林羽

摘要：目的? 觀察芍藥苷對腦缺血再灌注損傷大鼠NLRP3炎癥體信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法 ?SPF級雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷高劑量組，每組12只。采用線栓阻斷法制作大鼠腦缺血再灌注模型，缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注后1 h腹腔注射芍藥苷（2.5、5 mg/kg），每日1次，連續(xù)7 d。Zea Longa 5分評價(jià)方法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。ELISA檢測大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α的含量。RT-PCR和Western blot分別檢測大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果? 與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評分各時(shí)點(diǎn)均降低，芍藥苷低劑量組第7日和芍藥苷高劑量組第3、5、7日神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào);與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論? 芍藥苷對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥體信號通路分子的表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：腦缺血再灌注損傷;芍藥苷;NLRP3;NLRP1;Caspase-1;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.010????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of paeoniflorin on cerebral ischemic-reperfusion injury through NLRP3 inflammatory signaling pathway; To explore its neuroprotective mechanism. Methods Totally 48 SPF male SD rats were randomly divided into four groups with 12 rats in each group： sham-operation group， cerebral ischemic-reperfusion group， paeoniflorin high- and low-dosage groups. Suture-occluded method was used to block middle cerebral artery and I/R model of SD rats was made. Paeoniflorin 2.5， 5 mg/kg （one time per day and for seven days） were administrated by intraperitoneal injection after 2 h ischemic and 1 h reperfusion. Zea Longa 5-point evaluation method was used for neurological impairment score in rats. Contents of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α were detected by ELISA. Western blot and RT-PCR were used to detect the protein and gene expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α， as well as Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 in brain tissue. Results Compared with the model group， the neurological scores of paeoniflorin high- and low-dosage groups decreased at different time points; there were statistical significance in the neurological scores on the 7th day of paeoniflorin low-dosage groups and the 3rd， 5th and 7th day of paeoniflorin high-dosage groups （P<0.05， P<0.01）. Compared with sham-operation group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in the model group increased， and the expressions of IL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 mRNA and protein were up-regulated in rat brain in the model group; compared with the model group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in paeoniflorin high- and low-dosage groups significantly decreased， and IIL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1， NLRP3 mRNA and protein expression in brain tissue were significantly down-regulated （P<0.01）. Conclusion Paeoniflorin has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to inhibition of molecule expression of NLRP3 inflammatory signaling pathway， thereby reducing inflammation.

Keywords： cerebral ischemia-reperfusion injury; paeoniflorin; NLRP3; NLRP1; Caspase-1; rats

腦卒中具有發(fā)病率、病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，隨著人口步入老齡化社會，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其中缺血性腦卒中約占腦卒中發(fā)病的80%，是一個(gè)涉及多種機(jī)制、多個(gè)階段、多種細(xì)胞各自及相互作用的過程[1]。芍藥苷是白芍中主要活性成分之一，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗肝纖維化[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。近年來，芍藥苷在腦損傷方面的作用受到越來越多的關(guān)注。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過抑制神經(jīng)元凋亡、調(diào)控Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路，發(fā)揮對腦缺血再灌注（ischemic-reperfusion，I/R）損傷的保護(hù)作用[7-8]。本研究建立腦I/R損傷大鼠模型，觀察芍藥苷對I/R損傷大鼠NLRP3炎癥體信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為臨床尋找治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（260±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXX（滬）2017-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號2015000547928。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2? 藥物

芍藥苷，中國食品藥品檢定研究院提供，批號110736-201033。

1.3? 主要試劑與儀器

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher，K1622），Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo Fisher，4367659），Caspase-1多克隆抗體（Abcam，ab1872），NLRP1多克隆抗體（Abcam，ab3683）;NLRP3多克隆抗體（Novusbio，NBP2-12446），β-actin抗體（Cell Signaling Technology，#4970），SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），HRP結(jié)合山羊抗兔 IgG、HRP結(jié)合兔抗鼠 IgG（廈門鷺隆生物科技有限公司）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppLied Biosystems，型號7900HT），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，型號ChemiDoc XRS+），高速臺式冷凍離心機(jī)（ThermoFisher，型號PrimoR），線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，型號3600）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 造模

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（12只）和造模組（36只），術(shù)前12 h禁食不禁水，次日根據(jù)前期造模方法[7-8]進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞手術(shù)。造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA），并結(jié)扎，分離頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），將線栓經(jīng)CCA插入ICA至顱內(nèi)大腦前動(dòng)脈的近端（18～20 mm），停止插線以阻斷該側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，導(dǎo)致腦缺血，阻塞2 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作同造模組。

2.2? 大鼠神經(jīng)功能評分

術(shù)后24 h根據(jù)Zea Longa 5分評價(jià)方法[8]對腦I/R損傷大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評價(jià)，將大鼠神經(jīng)癥狀分為0～4分。0分：無神經(jīng)功能缺損;1分：提尾時(shí)右前肢內(nèi)收，不能完全伸展;2分：自發(fā)行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：行走時(shí)身體向右側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。選擇評分為1～3分造模成功大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3? 分組和給藥

將造模組大鼠分為模型組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組，每組12只。再灌注后1 h，芍藥苷低、高劑量組大鼠分別腹腔注射芍藥苷2.5、5 mg/（kg·d），假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。給藥體積0.6 mL/100 g，每日1次，連續(xù)7 d。

2.4? ELISA檢測血清相關(guān)炎癥因子含量

末次給藥后，大鼠麻醉腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min離心10 min，收集上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量檢測。

2.5? RT-PCR檢測腦組織相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)

末次給藥后，大鼠麻醉取左側(cè)腦組織100 mg。Trizol法提取總RNA，檢測A260、A280，取A260/A280在1.8～2.0的樣品，計(jì)算總RNA濃度。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，各目的基因擴(kuò)增引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：50 ℃預(yù)熱2 min，95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用ABI7900熒光定量PCR儀上軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

2.6? Western blot檢測大鼠腦組織Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達(dá)

末次給藥后，大鼠麻醉取左側(cè)腦組織100 mg，加入含1%PMSF裂解液1 mL，研磨，12 000×g離心10 min，取上清液，采用BCA法測樣品蛋白濃度，并計(jì)算30 μg樣品蛋白的體積。加入1/4體積5×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃變性7 min。常規(guī)12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入稀釋的一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，次日TBST洗3次×10 min，加入1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次×10 min。加ECL顯色劑，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量，并分析組間差異。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間差異用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 芍藥苷對模型大鼠神經(jīng)功能損傷的影響

模型組大鼠術(shù)后3 d神經(jīng)功能損傷情況逐漸加重，神經(jīng)功能評分較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低劑量組第1、3、5日和芍藥苷高劑量組第1日大鼠神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，芍藥苷低劑量組第7日和芍藥苷高劑量組第3、5、7日大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖1。

4.2? 芍藥苷對模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2。

4.3? 芍藥苷對模型大鼠腦組織相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

4.4? 芍藥苷對模型大鼠腦組織相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖4、圖5。

5? 討論

近年研究顯示，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP1和NLRP3炎癥小體可能在缺血性腦中風(fēng)的細(xì)胞損傷方面和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中扮演著重要角色[9-11]。I/R損傷涉及多種因素相互作用的炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程，在此過程中，NLRP3炎癥小體被激活，隨后釋放Caspase-1、IL-1β等炎性物質(zhì)，持續(xù)作用于損傷組織，加重組織的損傷[9]。所以，抑制或阻斷NLRP3炎性體的激活可能為I/R損傷所引起的炎癥提供新的治療策略。在缺血性腦中風(fēng)發(fā)生后，NLRP3或NLRP1蛋白與Caspase-1前體和ASC等結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物NLRP3或NLRP1炎癥小體，炎癥小體形成后，Caspase-1前體通過自身催化作用被激活，激活后的Caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前體，使之形成具有活性的成熟形式并隨即釋放進(jìn)胞外環(huán)境與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，介導(dǎo)下游MAPK和核因子-κB通路，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元增殖、凋亡[12-13]。

本研究結(jié)果表明，低劑量芍藥苷可顯著降低大鼠第7日神經(jīng)評分，高劑量芍藥苷可顯著降低大鼠第3、5、7日神經(jīng)評分，改善神經(jīng)功能損傷，驗(yàn)證了芍藥苷對腦I/R損傷大鼠的保護(hù)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可明顯降低大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量。被激活后的NLRP3炎性體可促進(jìn)Caspase-1表達(dá)，并進(jìn)一步導(dǎo)致IL-1β、IL-6、TNF-α等與炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子的活化[14]。

綜上所述，芍藥苷能有效抑制腦I/R損傷后缺血腦組織Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)，并能降低NLRP3炎癥體信號通路下游的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，提示芍藥苷可抑制NLRP3信號通路的激活，從而減輕腦I/R損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1] GO A S， MOZAFFARIAN D， ROGER V L， et al. Heart disease and stroke statistics - 2014 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2014，129：399-410.

[2] ZHU S H， LIU B Q， HAO M J， et al. Paeoniflorin suppressed high glucose-induced retinal microglia MMP-9 expression and inflammatory response via inhibition of TLR4/NF-κB pathway through upregulation of SOCS3 in diabetic retinopathy[J]. Inflammation，2017，40（5）：1475-1486.

[3] 郭春燕，羅強(qiáng)，孫黎，等.芍藥苷對H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中草藥，2013，44（20）：2864-2871.

[4] HU Z， QIN F， GAO S， et al. Paeoniflorin exerts protective effect on radiation-induced hepatic fibrosis in rats via TGF-β1/Smads signaling pathway[J]. American Journal of Translational Research，2018，10（3）：1012-1021.

[5] LI H， JIAO Y， XIE M. Paeoniflorin? ameliorates atherosclerosis by suppressing TLR4-mediated NF-κB activation[J]. Inflammation， 2017，40（6）：2042-2051.