易志勇， 韓清民， 郭斯印

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東廣州510375）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種由于關(guān)節(jié)軟骨損傷而引起的韌帶、肌腱、膝周關(guān)節(jié)囊等諸多組織發(fā)生病變的一種骨科常見病，其確切發(fā)病機(jī)制尚未清楚，多發(fā)生于老年人群，該病嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，甚至成為老年人致殘的疾患之一[1，2]。目前，隨著我國(guó)人口老齡化問題的日益嚴(yán)重，KOA發(fā)病率逐年上升，這不僅給患者自身帶來巨大的痛苦，也給患者家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。研究[4]表明，引起KOA發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素有年齡（＞45歲）、性別（女性發(fā)病率明顯高于男性）、肥胖、遺傳因素以及膝關(guān)節(jié)外傷史或手術(shù)史等。近年來，KOA由于其高發(fā)病率和高致殘率，已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，同時(shí)也進(jìn)行了大量的臨床研究，但由于KOA復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前并沒有找到更有效的治療方法。目前，臨床上主要采取生物制劑、外科手術(shù)治療和基因治療3種治療手段[5，6]。基因治療是一種新型的KOA治療手段[7]，該方法可以將生物制品釋放到特定靶點(diǎn)進(jìn)而達(dá)到治療目的，但是由于基因治療的費(fèi)用比較昂貴，目前并沒有廣泛應(yīng)用于臨床治療中。雌激素受體（estrogen receptor，ER）包括核受體和膜受體，ERa是一種核受體，位于胞漿或胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的作用，可以介導(dǎo)雌激素的基因型效應(yīng)[8]。ERa可通過與靶基因中的雌激素特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，研究表明，ERa基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）可能導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，導(dǎo)致ER表達(dá)、功能異常，從而引起一系列疾病發(fā)生。已有研究報(bào)道，ERa基因多態(tài)性與女性月經(jīng)過少、乳腺癌以及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[9，10]。本研究旨在探討ERa基因多態(tài)性與女性KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的相關(guān)性，以期從基因?qū)用骊U述KOA的發(fā)病機(jī)制，為KOA的臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月至2017年12月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科門診及住院部就診且明確診斷為KOA的180例患者作為病例組?；颊叩钠骄挲g為55.2歲（45.8～73.7歲），病程最短2年，最長(zhǎng)28年，平均11.8年；同時(shí)，選取180例同時(shí)期在本院體檢部門進(jìn)行體檢的正常人群作為健康對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組），所有研究對(duì)象均為女性。本研究已獲得所有研究對(duì)象的知情同意，并符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1995年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的KOA診斷分類標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①均經(jīng)臨床確診為KOA；②年齡在45～75歲之間；③知情并同意參加本研究的患者。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡在45歲以下及75歲以上的患者；②不符合上述KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；③精神病患者；④患有心血管、肝腎等嚴(yán)重疾病的患者；⑤局部有軟組織感染的患者；⑥患有骨腫瘤、結(jié)核、類風(fēng)濕性和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的患者。

1.3 試劑與儀器 全血基因組純化試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），iPLEX Gold試劑盒（美國(guó)Sequenom公司）；MassArray質(zhì)譜儀（美國(guó)Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.4 血樣采集及DNA提取 采集每位研究對(duì)象外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝管中，現(xiàn)場(chǎng)編號(hào)并登記姓名，所有標(biāo)本采集當(dāng)天送回實(shí)驗(yàn)室，置于-70℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5 基因分型 從NCBI和HapMap數(shù)據(jù)庫中查詢ERa基因的多態(tài)性位點(diǎn)，選擇在中國(guó)人群（CHB）最小等位基因頻率≥5%的位點(diǎn)，最終確定了ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)作為本研究中的位點(diǎn)。采用Sequenom MassArray SNP基因分型技術(shù)對(duì)所選擇的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。qPCR單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成，ERa受體序列為P1：5’-CTGCCACC CTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’；P2：5’-T CTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3’。反應(yīng)在MassArray質(zhì)譜儀中進(jìn)行，基因分型使用Sequenom MassArray RS1000軟件進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用方差分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析法。采用精確檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)，評(píng)估對(duì)照組的可靠性。計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因及基因型頻數(shù)，采用χ2檢驗(yàn)比較兩組間各位點(diǎn)的等位基因頻率分布差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步確定檢測(cè)的位點(diǎn)是否與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型有相關(guān)性。應(yīng)用SNPStats在線軟件（http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）測(cè)定ERa基因的PvuⅡ和XbaⅠ兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的關(guān)系。以相對(duì)優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）來評(píng)估ERa基因的多態(tài)性位點(diǎn)與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），說明本研究所選擇的樣本具有群體代表性。

2.2 ERa基因多態(tài)性分布特點(diǎn) 本研究對(duì)ERa基因上的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)PvuⅡ和XbaⅠ進(jìn)行基因分型，利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)并分析比較各個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組中是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并對(duì)年齡和性別進(jìn)行校正。結(jié)果顯示ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在病例組與對(duì)照組存在明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 病例組與對(duì)照組ERa基因多態(tài)性分布比較Table 1 Com parison of the distribution of ERa genetic polymorphisms between the case group and controlgroup n（p/%）

2.3 ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在等位基因模型下，PvuⅡ多態(tài)性與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性[P等位基因（OR=2.53；95%CI，0.73-1.38；P=0.54），p等位基因（OR=1.36；95%CI，0.35-1.25；P=0.15）]；在等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)的x等位基因（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035）與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，X等位基因（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.36）與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性。此外，本研究還通過卡方檢驗(yàn)，比較了基因型頻率分布在病例組和對(duì)照組中是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并對(duì)年齡和性別進(jìn)行校正。結(jié)果顯示：與參考基因型PP相比，PvuⅡ多態(tài)性位點(diǎn)與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性（P＞0.05）；XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的Xx基因型頻率在病例組和對(duì)照組中存在顯著性差異（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045），說明其能顯著增加KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果見表2。

表2 ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA n（p/%）

2.4 ERa基因多態(tài)性在不同遺傳模型下與KOA相關(guān)性分析 通過無條件邏輯回歸模型，引入3種遺傳模型（顯性、隱性和加性），分別計(jì)算各位點(diǎn)等位基因的OR和95%CI，衡量各位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)OA風(fēng)險(xiǎn)的效應(yīng)大小，并按照性別、年齡修正。結(jié)果顯示：在顯性模型下，XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的最小等位基因X與增加KOA患病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多態(tài)性位點(diǎn)在3種遺傳模型下均與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

2.5 ERa基因多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析 根據(jù)KOA的中醫(yī)證型，本研究將180例患者分為寒濕阻絡(luò)型、濕熱阻絡(luò)型、瘀血阻絡(luò)型、肝腎兩虛型以及混合型5組進(jìn)行分層，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的基因型及等位基因均與KOA的濕熱阻絡(luò)型和混合型這兩個(gè)證型具有相關(guān)性（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表4、表5。

表3 ERa基因多態(tài)性在不同遺傳模型下與KOA相關(guān)性分析Table 3 Correlation of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA in various geneticmodels

表4 ERa基因PvuⅡ多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析Table 4 Stratified analysis for the correlation of ERa PvuⅡpolymorphism s w ith TCM syndrome types

表5 ERa基因XbaⅠ多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析Table 5 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ith TCM syndrome types

2.6 ERa基因多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析 根據(jù)KOA的經(jīng)筋分型，可以將KOA患者分為足太陽經(jīng)筋型、足少陽經(jīng)筋型、足陽明經(jīng)筋型、足三陰經(jīng)筋型（足太陰經(jīng)筋型、足少陰經(jīng)筋型以及足厥陰經(jīng)筋型）4種類型。根據(jù)KOA的經(jīng)筋分型對(duì)其進(jìn)行分層，并分析ERa基因多態(tài)性與經(jīng)筋分型的相關(guān)性，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ多態(tài)性基因型和等位基因與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多態(tài)性基因型與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05），等位基因x與足陽明經(jīng)筋型和足三陰經(jīng)筋型具有相關(guān)性（P＜0.01）。結(jié)果見表6、表7。

表6 ERa基因PvuⅡ多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析Table 6 Stratified analysis for the correlation of ERa PvaⅡpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

表7 ERa基因XbaⅠ多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析Table 7 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是引起老年人疼痛和傷殘的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。中老年女性為KOA的多發(fā)人群，這可能與女性患者的鈣流失嚴(yán)重以及激素水平的變化有一定的關(guān)系[13]。ERa基因?yàn)橐环N雌激素受體，可通過與雌激素的結(jié)合而引起下游基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過病例—對(duì)照的研究設(shè)計(jì)，利用MassArray技術(shù)檢測(cè)了ERa基因的PvuⅡ與XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)，并分析該基因的多態(tài)性位點(diǎn)與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的相關(guān)性，探討KOA發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為KOA的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。本次研究中我們所納入的患者均為女性，這樣能更好地解釋雌激素水平與KOA發(fā)病的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示：ERa基因XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組有顯著性差異，病例組人群等位基因x頻率分布明顯高于對(duì)照組人群，可以顯著增加KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035），X等位基因與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.360）。通過各位點(diǎn)的基因型頻率比較發(fā)現(xiàn)，與參考基因型PP相比，PvuⅡ多態(tài)性位點(diǎn)與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性（P＞0.05）；XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的Xx基因型頻率在病例組和對(duì)照組中存在顯著性差異，能顯著增加KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045）。通過無條件邏輯回歸模型，我們發(fā)現(xiàn)在顯性模型下，XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的最小等位基因X與增加KOA患病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多態(tài)性位點(diǎn)在3種遺傳模型下均與KOA的患病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性（P＞0.05）。

此外，我們還根據(jù)KOA的中醫(yī)證型，對(duì)所有女性KOA患者進(jìn)行了分層分析，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的基因型及等位基因均與KOA的濕熱阻絡(luò)型和混合型這2個(gè)證型具有相關(guān)性（P＜0.05或P＜0.01）。KOA經(jīng)筋分型的分層分析結(jié)果表明，ERa基因PvuⅡ多態(tài)性基因型和等位基因與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多態(tài)性基因型與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05），而等位基因x與足陽明經(jīng)筋型和足三陰經(jīng)筋型具有相關(guān)性（P＜0.01）。雖然目前還沒有研究表明ERa基因多態(tài)性與KOA易感性之間的關(guān)系，但是我們已從現(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)ERa基因多態(tài)性與女性的雌激素水平之間的關(guān)系，此外，亦有研究證明ERa基因多態(tài)性與乳腺癌之間的關(guān)系。因此，在后續(xù)的功能試驗(yàn)中我們還會(huì)繼續(xù)增大樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證ERa基因多態(tài)性與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，以及從功能學(xué)方面去研究這些多態(tài)性位點(diǎn)與KOA易感性之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究結(jié)果表明ERa基因多態(tài)性與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)之間存在相關(guān)性，尤其是ERa基因XbaⅠ多態(tài)性位點(diǎn)，表明ERa基因多態(tài)性在KOA的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用，這就為KOA的早期診斷與預(yù)防提供了新的候選基因位點(diǎn)，也為該疾病發(fā)生機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)?；蚨鄳B(tài)性與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系是目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于疾病發(fā)病的遺傳機(jī)制研究比較多的一個(gè)方向，也是最能從基因?qū)用嫔辖忉尲膊“l(fā)病機(jī)制的一種研究方法，該方法可以為疾病的早期預(yù)防及臨床治療提供依據(jù)[14，15]。但是該研究方法得出的結(jié)果往往不是很明確，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)受到遺傳因素和種族差異的影響。此外，研究樣本的選擇偏倚、不同實(shí)驗(yàn)室所用方法的差異等均會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，因此，也給該研究方法的使用帶來了很多的局限性。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了ERa基因上與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，但是本研究也存在一些缺點(diǎn)，比如樣本量相對(duì)較少等，因此，在后續(xù)的研究中，我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步在大量人群中去驗(yàn)證這些多態(tài)性位點(diǎn)及其與KOA患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性；其次，我們沒有進(jìn)行候選SNP位點(diǎn)的功能學(xué)研究，所以在后續(xù)的研究中我們還需用功能實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證候選基因與KOA的相關(guān)性；最后，我們?nèi)孕枰诓煌娜巳褐腥ヲ?yàn)證這些多態(tài)性位點(diǎn)，以期為其臨床診斷及治療提供依據(jù)。