王艷華 熊 彥 劉仁鵬 宋榮峰 唐建軍

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在全球癌癥中發(fā)病率居第4位，患者5年生存率為64.3%，當(dāng)晚期CRC發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移時(shí)，5年生存率僅為5%～8%[1-2]。50%～60%CRC患者就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中80%～90%已不可手術(shù)切除，治療手段非常有限[3]。目前，CRC發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，研究轉(zhuǎn)移性CRC中異常表達(dá)分子在CRC轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制，有助于進(jìn)行準(zhǔn)確的CRC分子分型。新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，有助于轉(zhuǎn)移性CRC的早期診斷和生存期的延長。

EMI1又名早期有絲分裂抑制物(Emi1)，屬于F-box家族蛋白，可參與組成Skp1-Cul1-F-box-protein (SCF)泛素連接酶，介導(dǎo)蛋白的泛素化降解[4]。EMI1(Emi1)在腫瘤中的表達(dá)及功能有待研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Cocktail 蛋白酶抑制劑(Calbiochem)，丙烯酰胺(Bio-Rad)，TEMED(Sigma addrich)，PVDF膜(Roche),BSA(Promega)，Anti-EMI1 antibody(HPA029048)，sigma aldrich)。 5×SDS-PAGE上樣緩沖液：取1 mol/l Tris-HCl (pH 6.8) 1.25 ml,0.5 g SDS,2.5 ml甘油,25 mg溴酚藍(lán)加去離子水定容至5 ml，每只500 μl分裝，用前每小份加入25 μl β巰基乙醇。5×SDS-PAGE 電泳緩沖液：稱取15.1 g Tris base,94 g甘氨酸,5.0 g SDS,加入800 ml去離子水，攪拌溶解，定容至1 000 ml。膜轉(zhuǎn)移緩沖液：稱取5.8 g Tris base,2.9 g甘氨酸,0.37 g SDS,加入600 ml去離子水，攪拌溶解，定容至800 ml，加入200 ml甲醇。10×TBE：540 g Tris 堿與275 g硼酸溶于1000 ml 0.5 mol/l EDTA 中。1.2 % Agarose：Agarose 1.2 g，溶于1×TBE 50 ml中，微波加熱沸騰后制膠。0.5 mol/l EDTA緩沖液(pH 8.0)：700 ml水中溶解186.1 g EDTA·2H2O，用10 mmol/l NaOH調(diào)至pH 8.0,加去離子水至1 000 ml。

1.2 主要方法

1.2.1 RT-PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR，總反應(yīng)體積50.0 μl，其中5× OneStep RT-PCR buffer 10.0 μl，dNTP Mix 2.0 μl，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μl，5×Q-Solution 10.0 μl，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/l。擴(kuò)增條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃初始化15 min，94 ℃變性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30～35個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。擴(kuò)增引物為：5'-GCTGTCATGTATTGGGTCACC-3' (forward),5'-GTCTACTGGTCTCTAGTGCTTCT-3' (reverse),擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：146 bp，取RT-PCR產(chǎn)物10.0 μl，加上樣緩沖液2.0 l，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 Western Blot ⑴SDS-PAGE電泳:樣品中加入1/5體積的5×SDS-loading buffer，99 ℃煮5 min充分變性。將凝膠固定于電泳裝置上，加入電泳緩沖液。每空約50 μg的總蛋白量上樣。濃縮膠穩(wěn)壓80 V，分離膠120 V，電泳至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部時(shí)，關(guān)閉電源。

⑵轉(zhuǎn)膜:PVDF膜純甲醇浸泡飽和30 s，按海綿→濾紙→膠→膜→濾紙→海綿，每層放好后，用玻璃棒趕去氣泡。膠放于負(fù)極面(黑色面)。將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，將夾子夾好放入轉(zhuǎn)膜槽，加轉(zhuǎn)移緩沖液，200 mA恒流2～4 h。

⑶封閉以及抗體孵育:用鑷子小心夾出PVDF膜放入5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h。一抗孵育：棄去封閉液，TBST清洗2次，用3%的BSA稀釋Anti-EMI1 antibody (HPA029048，sigma aldrich)，與膜一起4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育：HRP偶聯(lián)的二抗用5%的脫脂奶粉/TBST按1∶10 000稀釋，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。

⑷顯色、X光片壓片，顯影、定影。

1.2.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC) 收集2004年5月至2009年11月中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的240例結(jié)直腸癌患者手術(shù)病例相關(guān)臨床病理資料，切片后按以下步驟免疫組織化學(xué)染色(IHC)。(1)脫蠟：0.45 μm石蠟切片60 ℃溫箱烤片2 h；將切片取出后立即放置新鮮二甲苯缸中，浸泡10 min：重復(fù)一次；(2)梯度水化：將脫蠟后的切片依次經(jīng)100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，蒸餾水中梯度浸泡各3 min；(3)去除內(nèi)源性過樣化物酶的活性：將玻片甩干，置于3% H2O2中，室溫孵育30 min；(4)高壓抗原修復(fù)：將組織切片放入盛有的EDTA修復(fù)液(1 mmol/l pH 8.0)高壓鍋中，高壓3～4 min，從高壓鍋氣閥彈起冒氣時(shí)開始計(jì)時(shí)；自然冷卻1 h；取出放入蒸餾水中，浸泡3 min；(5)PBS洗滌3次，每次5 min；(6)IHC油性筆繞組織切片周圍劃圈,圈好后滴加羊血清封閉30 min。(7)一抗孵育：Anti-EMI1 antibody(HPA029048，sigma aldrich)按1∶100稀釋，覆蓋整張組織切片區(qū)域，4 ℃孵育過夜；(8)PBS緩沖液洗滌4次，每次3 min；(9)二抗孵育：滴加二抗，室溫孵育1 h；(10)PBS洗滌4次，每次3 min；(11) PBS洗滌4次，每次3 min；(12)DAB顯色2～3 min，清水沖洗終止反應(yīng)；(13)蘇木精復(fù)染1～2 min，鹽酸酒精分化1～3 s；(14)脫水干燥：30%乙醇，70%乙醇，100%乙醇梯度脫水，37 ℃溫箱烤片10～20 min；(15)中性樹脂封片，觀察。 陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：兩名臨床病理醫(yī)師雙盲法分別對(duì)染色情況進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞內(nèi)呈棕色顆粒者為陽性染色，根據(jù)染色細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)弱的程度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞率計(jì)分分為4個(gè)等級(jí)：0分(≤10%)，1分(>10%～25%)，2分(>25%～50%)，3分(>50%～75%)，4分(>75%)。染色強(qiáng)弱的強(qiáng)度分為4個(gè)等級(jí)：1分(淺棕色)，2分(棕色)，3分(深棕色)。最后總的染色情況按二者的乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級(jí)：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。結(jié)果判斷：將(-)和(+)定為陰性表達(dá)，(++)和(+++)定為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。其中P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson Chi-Square和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析EMI1表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，Kaplan-Meier method和log-rank test分析臨床預(yù)后，Cox regression回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 EMI1在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高

采用RT-PCR和Western blot檢測EMI1在結(jié)直腸癌的癌組織和癌旁組織臨床標(biāo)本中的mRNA和蛋白的表達(dá)。如圖1所示，PCR結(jié)果顯示，6例配對(duì)標(biāo)本中，與相應(yīng)配對(duì)的癌旁組織相比，癌組織中標(biāo)本中的EMI1的mRNA表達(dá)明顯升高(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示，12例配對(duì)標(biāo)本中，與相應(yīng)配對(duì)的癌旁正常組織相比，癌組織中EMI1的蛋白表達(dá)也明顯升高(圖1B)。

N為癌旁正常組織；T為癌組織。

2.2 EMI1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測240例確診的具有臨床病理和預(yù)后資料的結(jié)直腸癌患者石蠟標(biāo)本中EMI1的表達(dá)，病理醫(yī)生評(píng)分后，根據(jù)ROC曲線得出cut off值為5,以IHC評(píng)分值是否大于5分為高表達(dá)和低表達(dá)組，Pearson Chi-Square 和 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析EMI1表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示EMI1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)：臨床分期 (P=0.004),T分期 (P=0.011),M分期 (P=0.003)。EMI1表達(dá)高的結(jié)直腸癌患者臨床分期越高，遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的發(fā)生率越高(表1)。

2.3 EMI1高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后

進(jìn)一步采用Kaplan-Meier analysis和the log-rank test統(tǒng)計(jì)學(xué)分析EMI1表達(dá)和結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，圖2可見，EMI1高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的總生存期和無瘤生存期比EMI1表達(dá)低的患者短(P<0.001)，EMI1高表達(dá)預(yù)示結(jié)直腸癌患者預(yù)后差。

表1 EMI1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性/例

2.4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)因素分析

單因素分析顯示，與結(jié)直腸癌患者總生存期明顯相關(guān)的因素包括：EMI1表達(dá)(P<0.001),T分期(P<0.001),N分期(P<0.001),M分期 (P<0.001)和病理分化(P=0.001)。如表2的多因素回歸分析結(jié)果顯示，EMI1表達(dá)，N分期和M分期是結(jié)直腸癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，EMI1表達(dá)(P=0.041)，N分期(P<0.001)和M分期(P=0.001)。

圖2 EMI1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

變量 例數(shù)單因素分析總生存時(shí)間/月P多因素分析HR95%CIPEMI1表達(dá)<0.0011.5581.019～2.3840.041 低表達(dá)129109 高表達(dá)11179年齡0.4610.9370.617～1.4230.761 ≤508990 >5015187性別0.8180.8680.576～1.3080.499 男性13195 女性10986T分期<0.0011.2060.871～1.6710.259 T1+T248103 T36683 T412678N分期<0.0012.8871.781～4.681<0.001 N0113119 N+(N1andN2)12770M分期<0.0012.6951.741～4.173<0.001 M018597 M15551分化0.0011.4200.976～2.0670.067 良23106 中等16097 差5771

3 討論

EMI1是E2F轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，為聚集有絲分裂期周期蛋白和S和G2期其他的重要細(xì)胞周期調(diào)控因子所必須的[5-6]。EMI1在一些癌中高表達(dá)且發(fā)揮重要功能。慢性髓細(xì)胞樣白血病(CML)中，Bcr-Abl 增強(qiáng)Emi1的磷酸化和穩(wěn)定性，進(jìn)而阻止SKP2的降解促進(jìn)CML細(xì)胞的增殖[7]；在肝細(xì)胞癌中Emi1促進(jìn)增殖，調(diào)控SKP2穩(wěn)定性和p27降解[8]。Emi1與卵巢透明細(xì)胞癌的高FIGO分期和不良預(yù)后相關(guān)[9]。乳腺癌中，Emi1與組織學(xué)級(jí)別和預(yù)后相關(guān)，影響PI3K/Akt細(xì)胞增殖通路[10]。敲除Emi1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素和X射線輻照敏感性[11]。EMI1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義尚不清楚。

在此項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)EMI1在結(jié)直腸癌中存在表達(dá)失調(diào)，與正常癌旁組織相比，腫瘤組織中EMI1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都有上調(diào)的趨勢，并且臨床分期越高的結(jié)直腸癌患者EMI1表達(dá)水平越高；病理分化越差的結(jié)直腸癌患者EMI1表達(dá)水平也越高。EMI1高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的生存期比EMI1表達(dá)高的患者短。EMI1高表達(dá)預(yù)示結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。對(duì)于EMI1在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用及其具體分子機(jī)制，有待于將來進(jìn)一步采用基因敲除或過表達(dá)等手段進(jìn)行功能研究。在我們目前的在結(jié)直腸癌患者臨床標(biāo)本上檢測EMI1的表達(dá)，分析其與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系，提示EMI1在結(jié)直腸癌上可能會(huì)具有癌基因作用，可能與CRC的轉(zhuǎn)移有關(guān)。闡明EMI1在結(jié)直腸癌上的預(yù)后意義，不僅有助于結(jié)直腸癌的早期診斷和治療，并且對(duì)深入探究EMI1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能能起到一定的提示作用。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多階段的過程，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因失活等一系列的變化。K-RAS體細(xì)胞突變、APC基因、p53、BRAF、PIK3CA、SMAD4、FBXW7和PTEN等基因突變表達(dá)失調(diào)和染色體不穩(wěn)定和微衛(wèi)星不穩(wěn)定是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和藥物治療反應(yīng)敏感性方面密切相關(guān)的分子遺傳學(xué)變化[12-13]。研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的病理過程中異常表達(dá)的生物大分子，有助于闡明結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌藥物治療靶點(diǎn)。我們?cè)贑RC上對(duì)EMI1分子的研究結(jié)果可以為結(jié)直腸癌診斷的分子分型以及個(gè)體化治療提供一定的理論依據(jù)，也可為CRC的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。我們的研究具有一定的提示作用，然而EMI1在結(jié)直腸癌上的具體生物學(xué)功能及分子機(jī)制有待將來進(jìn)一步的細(xì)胞分子生物學(xué)研究，比如在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中敲低或過表達(dá)EMI1后觀察細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移能力的變化，以及相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)手段明確EMI1下游靶基因。

綜上所述，EMI1在結(jié)直腸癌中表達(dá)失調(diào)升高，EMI1高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且預(yù)示結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后。EMI1可能可以作為結(jié)直腸癌的一個(gè)新的預(yù)后指標(biāo)。