馬靜，王靜，姚鵬偉，葉紅潮，余海濤，王鵬，李玉寶，葉協(xié)鋒*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2 洛陽(yáng)市煙草公司，洛陽(yáng) 471000；3 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)沙 410000；4 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430000

我國(guó)鹽漬化土壤面積約3600萬hm2，占全國(guó)可利用土地面積的4.88%[1]，主要分布在東北、西北和華北地區(qū)。近年來，由于農(nóng)藥的濫用及灌溉、施肥方式的不合理，造成土壤鹽漬化越來越普遍，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。研究表明植物葉片細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其耐鹽性密切相關(guān)[3-4]，尤其是葉肉細(xì)胞中葉綠體、細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境變化較敏感。目前，相關(guān)研究主要集中在小麥、水稻等以采收籽粒為主的作物上[5]，對(duì)烤煙等以采收葉片為主的作物研究較少。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，獲得了通過提高活性氧清除酶的活性來應(yīng)對(duì)逆境的機(jī)制，從而保證作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[6]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）是生物膜保護(hù)酶系統(tǒng)的重要成員。在逆境條件下，它們協(xié)同作用，從而減輕活性氧自由基對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，抑制膜脂的過氧化[7-8]。其中，SOD能催化體內(nèi)的歧化反應(yīng)，將超氧自由基轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，而CAT和POD則負(fù)責(zé)清除SOD分解產(chǎn)生的H2O2，使其分解成沒有毒害的H2O和O2[9]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是自由基作用于脂膜發(fā)生氧化反應(yīng)的產(chǎn)物[10]，在一定程度上能反應(yīng)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受氧化的破壞程度[11]。Apel[12]等的研究表明，當(dāng)植株受到鹽脅迫后，會(huì)誘導(dǎo)植株體內(nèi)活性氧增多，造成細(xì)胞膜脂過氧化，從而影響植物正常生長(zhǎng)。朱玉鵬[13]等研究發(fā)現(xiàn)，在一定鹽分濃度范圍內(nèi)，冬小麥的SOD、POD活性增強(qiáng)，MDA含量會(huì)隨鹽濃度的增加而增加。隨著鹽濃度的升高，木薯幼苗[14]中的SOD、POD的活性先增強(qiáng)后減弱，CAT活性先下降后上升。

目前，植物鹽脅迫研究中大都采用NaCl或Na2SO4[15-16]，而對(duì)多種鹽混合脅迫或者不同鹽分脅迫對(duì)比研究未見報(bào)道。有研究表明，植物吸收過多的SO42-會(huì)引起植物缺鈣，使植物葉片發(fā)黃、從葉柄處脫落；吸收過多的Cl-會(huì)使植株生長(zhǎng)停滯、葉片黃化，葉緣似燒傷狀[17]。對(duì)于烤煙來說，吸收過多硫，會(huì)使煙葉燃燒性下降，在燃燒過程中會(huì)出現(xiàn)惡臭味；過多的Cl-會(huì)使葉片淀粉含量增多，葉片肥厚而脆，葉面光滑，顏色不均勻[18]。本研究選取NaCl和Na2SO4兩種鹽來模擬鹽脅迫環(huán)境，比較烤煙在不同濃度的兩種鹽處理?xiàng)l件下，葉片抗氧化酶活性的變化以及葉綠體、線粒體和細(xì)胞核等葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)，從解剖學(xué)角度探究?jī)煞N鹽對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的差異，并結(jié)合抗氧化酶等生理指標(biāo)，探討烤煙葉肉細(xì)胞對(duì)NaCl和Na2SO4的不同反饋機(jī)制以及烤煙鹽脅迫傷害的生理響應(yīng)規(guī)律，以期為烤煙的耐鹽機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年8月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，供試品種為中煙100。首先用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液在蛭石中培育煙苗，待長(zhǎng)至四葉一心時(shí)（苗齡為40 d），選取無病蟲害且長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯煙苗，分別添加100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/LNaCl的 Hoagland溶液和50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/LNa2SO4的Hoagland溶液作為處理[5,19-20]，對(duì)照組為正常Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每組5株，3次重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

電鏡制樣及觀察測(cè)量：在處理3 d后，從下往上數(shù)第3片葉作為電鏡觀察材料。在葉片中部，避開主脈附近切下2 mm×2 mm左右的葉片，在0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.2）配制的2.5%戊二醛溶液中在0～4℃下固定24 h以上，之后用磷酸緩沖液清洗3次，各30 min；再用1%的鋨酸固定2 h，然后用磷酸緩沖液清洗并用梯度酒精（30%、50%、70%、90%各15 min，100%酒精2次各30 min）脫水，再用100%丙酮置換，之后用環(huán)氧樹脂812包埋（樹脂組織處理器 LEICA EM TP），用超薄切片機(jī)（LEICA EM UC7）切片后用飽和醋酸雙氧鈾水溶液染色，再用檸檬酸鉛溶液染色后用透射電子顯微鏡（JEM-1400，日本）觀察拍照。

在處理3 d后，從下往 取第3片葉中稱取0.1 g樣品加入1 mL 150 mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液，冰浴上研磨，8000 g、4℃離心10 min，上清液部分為酶粗提取液，用于 MDA、SOD、POD和CAT的測(cè)定。MDA、SOD、POD和CAT的測(cè)定均按照MDA、SOD、POD和CAT試劑盒（蘇州科銘，蘇州，中國(guó)）中說明書的方法操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

正常的烤煙葉肉細(xì)胞中的葉綠體都緊貼細(xì)胞壁，長(zhǎng)軸與細(xì)胞壁平行，呈梭型或橢圓形，且各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰可見（圖1A）。用100 mmol/LNaCl處理后如圖1B所示：葉綠體排列有序，緊貼細(xì)胞壁，仍具有完整的結(jié)構(gòu)，但淀粉粒較CK有所減少。中等濃度（200 mmol/L）NaCl處理后，葉綠體與細(xì)胞壁之間出現(xiàn)間隙，且葉綠體中的嗜鋨顆粒含量有所增多，同時(shí)基粒片層結(jié)構(gòu)模糊，并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。葉綠體背膜部分邊緣模糊（圖1C）。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到400 mmol/L時(shí)，葉綠體縮小，結(jié)構(gòu)松散，背膜解體，失去完整性，與細(xì)胞質(zhì)間不再有明顯的界限。葉綠體中的質(zhì)體小球進(jìn)一步增多，基粒片層松散、變形，部分基粒解體消失（圖1D）。

在50 mmol/LNa2SO4處理后，烤煙葉綠體結(jié)構(gòu)仍呈梭型，形態(tài)飽滿，基粒片層排列整齊、有序，類囊體片層垛疊整齊，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)完整，且脂質(zhì)球的數(shù)目和大小沒有明顯的變化，但與100 mmol/LNaCl處理相比，葉綠體中的淀粉粒含量較多（圖1E）。當(dāng)Na2SO4處理濃度增高到100 mmol/L時(shí)，有部分葉綠體懸浮于細(xì)胞質(zhì)中，但大部分仍緊貼細(xì)胞壁。此時(shí)葉綠體結(jié)構(gòu)變長(zhǎng)，并有斷裂現(xiàn)象，類囊體結(jié)構(gòu)解體，與對(duì)照相比出現(xiàn)了更多的嗜鋨顆粒。基粒片層松散、變形，有斷裂的現(xiàn)象，垛疊之間出現(xiàn)明顯空隙，密度降低，膜邊緣模糊，同時(shí)葉綠體中的淀粉粒數(shù)量減少（圖1F）。當(dāng)Na2SO4濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，葉綠體由梭形進(jìn)一步腫脹變?yōu)榍蛐?，失去自身的完整結(jié)構(gòu)，內(nèi)部的類囊體消失，破損的葉綠體充斥在細(xì)胞質(zhì)中；嗜鋨顆粒明顯增多，葉綠體中鮮見淀粉粒（圖1G）。

圖1 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Influence of NaCl and Na2SO4 on the chloroplast structure of mesophyllcells of tobacco leaves

2.2 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響

由圖2A可知，未添加鹽溶液的烤煙葉肉細(xì)胞中，線粒體結(jié)構(gòu)飽滿，基質(zhì)豐富，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，可觀察到內(nèi)膜凹陷形成的嵴。當(dāng)100 mmol/LNaCl處理3天后，線粒體結(jié)構(gòu)與對(duì)照無明顯差別（圖2B）。當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，外膜結(jié)構(gòu)完整，部分線粒體呈扁球形，但與對(duì)照相比嵴的數(shù)量減少，內(nèi)膜系統(tǒng)可觀察到較多的嗜鋨顆粒，線粒體內(nèi)部出現(xiàn)空泡（圖2C）。當(dāng)NaCl濃度為400 mmol/L時(shí)，線粒體大部分內(nèi)膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞，無結(jié)構(gòu)清晰的嵴，內(nèi)部絕大部分為空泡，出現(xiàn)少數(shù)外膜破裂的現(xiàn)象（圖2D）。

圖2 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Influence of NaCl and Na2SO4 on mitochondrial structure of mesophyllcells of tobacco leaves

50 mmol/L Na2SO4和100 mmol/L Na2SO4處理后，與對(duì)照無明顯差別，線粒體結(jié)構(gòu)完整且形態(tài)飽滿，可明顯觀察到內(nèi)膜凹陷（圖2E、F）。當(dāng)Na2SO4濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，線粒體基質(zhì)密度明顯降低，內(nèi)膜幾乎完全溶解，且大部分線粒體結(jié)構(gòu)瓦解（圖2G）。

圖3 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Influence of NaCl and Na2SO4 on the nuclear structure of mesophyll cells of tobacco leaves

2.3 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組烤煙葉肉細(xì)胞的細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)完整，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰可見，核仁呈圓形，結(jié)構(gòu)完整，核中染色質(zhì)分布均勻（圖3A）。在用100 mmol/LNaCl處理后，細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，核仁結(jié)構(gòu)完整，但核仁邊緣略有模糊，核中染色質(zhì)均勻分布（圖3B）。200 mmol/LNaCl處理后，細(xì)胞核雖能觀察到核膜雙層結(jié)構(gòu)，但略有凹凸，核仁密度變小，且膜結(jié)構(gòu)損壞，核中染色質(zhì)分布不均（圖3C）。NaCl濃度升高至400 mmol/L時(shí)，核膜解體，核中的染色質(zhì)高度凝縮，細(xì)胞核邊緣模糊不清，部分細(xì)胞核核膜解體，核質(zhì)外溢，核仁消失（圖3D）。

50 mmol/L Na2SO4處理的葉片組織與對(duì)照相比細(xì)胞核結(jié)構(gòu)無明顯變化（圖3E）。100 mmol/L Na2SO4處理下細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)完整，平滑，染色質(zhì)分布均勻，但核仁邊緣略有模糊（圖3F）。200 mmol/L Na2SO4處理下大部分細(xì)胞核萎縮、破裂解體（圖3G）。

2.4 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁的影響

對(duì)不同濃度鹽分脅迫下烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁的透射電鏡照片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照的細(xì)胞壁表面光滑，結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞膜緊密貼合。在低濃度NaCl和Na2SO4條件下，葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁厚度減?。▓D4）。200 mmol/LNaCl處理?xiàng)l件下，烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁膨脹，細(xì)胞膜間隙增大。隨著NaCl濃度的升高，細(xì)胞壁表面凹凸不平，且邊緣模糊，細(xì)胞厚度有所減小。在100 mmol/LNa2SO4處理?xiàng)l件下，細(xì)胞壁厚度與對(duì)照相比無明顯變化。200 mmol/L Na2SO4處理?xiàng)l件下，細(xì)胞壁厚度降低。

圖4 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁的影響Fig.4 Influence of NaCl and Na2SO4 on the cell wall of mesophyll cells of tobacco leaves

2.5 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉片含水率的影響

從圖5可以看出，對(duì)照組的葉片含水率為95.00%，不同濃度NaCl處理后的含水率分別為94.13%、91.86%和83.47%；Na2SO4處理的含水率分別為94.65%、91.80%和89.58%。其中，低濃度NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉片含水率影響不大，隨鹽分濃度升高，烤煙葉片含水率逐漸下降，在Na+濃度一致條件下，高濃度（400 mmol/L）NaCl處理下烤煙葉片含水率與對(duì)照相比差異最顯著。低濃度NaCl和Na2SO4處理對(duì)烤煙葉片含水率影響不大，但隨著鹽分濃度的升高，烤煙葉片含水率逐漸下降。

圖5 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉片含水率的影響Fig.5 Influence of NaCl and Na2SO4 on moisture content of tobacco leaves

2.6 NaCl和Na2SO4對(duì)烤煙葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

從圖6可以看出，添加NaCl和Na2SO4溶液的煙草葉片中MDA含量、SOD、POD和CAT酶活變化趨勢(shì)相同。MDA含量、SOD和POD活性隨著鹽濃度的升高均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，而CAT活性是逐漸增強(qiáng)，且NaCl溶液處理的葉片比Na2SO4處理的MDA含量、SOD、POD和CAT活性的變化幅度更大，與對(duì)照相比差異更顯著。表明在Na+濃度相同條件下，NaCl對(duì)烤煙葉片氧化平衡影響較大，同時(shí)對(duì)細(xì)胞膜破壞程度也大。

3 討論

當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，葉片組織中各細(xì)胞器容易遭到破壞，而葉綠體是對(duì)鹽分最敏感的細(xì)胞器[21-24]。在本研究中，正常培養(yǎng)的煙草葉片葉綠體結(jié)構(gòu)完整，淀粉粒分布均勻，基粒片層清晰。在NaCl處理?xiàng)l件下，隨著NaCl濃度升高，葉綠體由飽滿的橢圓形逐漸變長(zhǎng)，膜結(jié)構(gòu)解體。Na2SO4處理?xiàng)l件下，隨著鹽濃度增加，葉綠體結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸膨脹，變成圓形，相比NaCl處理，Na2SO4對(duì)葉綠體膜結(jié)構(gòu)的影響較小，且低濃度Na2SO4對(duì)葉綠體中的淀粉粒幾乎沒有影響。然而有研究指出，在野大麥[20]葉肉細(xì)胞中，隨NaCl濃度升高，葉綠體中的淀粉粒含量增多，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相反，這可能是由于烤煙葉片和野大麥葉片的結(jié)構(gòu)差異較大，對(duì)鹽分的響應(yīng)不同。

線粒體是細(xì)胞能量的供給者，曾經(jīng)被認(rèn)為是對(duì)脅迫不敏感的細(xì)胞器[25-26]。但在本研究中，隨NaCl和Na2SO4濃度的升高，線粒體的結(jié)構(gòu)都發(fā)生明顯變化，在NaCl處理?xiàng)l件下，線粒體內(nèi)部間隙逐漸增大，膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。在Na2SO4處理?xiàng)l件下，線粒體內(nèi)嵴減少，膜結(jié)構(gòu)也相對(duì)完整。對(duì)于烤煙葉肉細(xì)胞細(xì)胞核來說，NaCl處理會(huì)造成細(xì)胞核內(nèi)核質(zhì)分布不均勻，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到400 mmol/L時(shí)，細(xì)胞核的雙層膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，但當(dāng)Na2SO4與NaCl處理中Na+濃度一致時(shí)，即達(dá)到200 mmol/L時(shí)，葉片中細(xì)胞核雙層膜結(jié)構(gòu)依然完整。由此可以推測(cè)，隨NaCl濃度升高，可能會(huì)抑制烤煙葉片伸展，導(dǎo)致葉色發(fā)黃，且在Na+濃度一致的條件下，NaCl與Na2SO4相比抑制作用更明顯。

研究表明，鹽脅迫會(huì)引起植物細(xì)胞中活性氧自由基的產(chǎn)生及其清除系統(tǒng)的破壞，而細(xì)胞質(zhì)膜破壞會(huì)積累較多的MDA，MDA的積累量也在一定程度上反映了耐鹽能力的強(qiáng)弱[27]。SOD、POD和CAT是植物應(yīng)對(duì)逆境的重要的抗氧化酶，它們主要通過清除超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥自由基來降低活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害和減輕膜質(zhì)過氧化[28-30]。本試驗(yàn)中，在低濃度和中等濃度NaCl和Na2SO4條件下，SOD、POD、CAT活性增強(qiáng)，MDA積累量增多，這可能是由于在鹽的作用下，烤煙葉片中活性氧自由基、過氧化氫等積累量升高，促使烤煙產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)，使抗氧化酶活性增強(qiáng)。隨著NaCl和Na2SO4濃度進(jìn)一步升高，SOD、POD活性降低，說明此時(shí)活性氧的積累量超出抗氧化酶可清除的范圍，葉片細(xì)胞受損嚴(yán)重。當(dāng)Na+濃度一致時(shí)，NaCl處理的烤煙葉片內(nèi)積累的MDA更多，SOD、POD、CAT活性變化也更顯著，這也從生理水平上反映出在NaCl處理下，烤煙葉肉細(xì)胞膜受傷害程度較深，表明與Na2SO4相比NaCl處理會(huì)使烤煙葉肉細(xì)胞產(chǎn)生更多的活性氧，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的破壞更強(qiáng)。

Na+和Cl-是對(duì)植物影響較大的鹽分離子，所以在鹽脅迫的研究中，如何避免Na+和Cl-毒害是當(dāng)前亟需解決的問題[31]。本研究利用不同濃度的Na2SO4和NaCl對(duì)烤煙進(jìn)行脅迫處理，從研究結(jié)果可以看出，NaCl對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞的影響比Na2SO4要大，這與大多數(shù)的研究一致，均認(rèn)為NaCl是主要的鹽害類型。楊春武[32]等人認(rèn)為，陽(yáng)離子對(duì)植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境具有重要意義，但陰離子也是維持細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞代謝過程的必要條件，所以不同的陰、陽(yáng)離子類型對(duì)植物的作用機(jī)制不同，在本試驗(yàn)中，雖然陽(yáng)離子相同，且濃度一致，但由于陰離子的不同，對(duì)烤煙產(chǎn)生的脅迫程度有明顯的不同，包括對(duì)葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)的影響均有所差異，所以對(duì)植物造成的鹽傷害與離子類型的關(guān)系，還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

當(dāng)NaCl濃度為100 mmol/L時(shí)，葉綠體中的淀粉粒減少； NaCl濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)，對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁厚度及抗氧化酶等產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)Na2SO4濃度為200 mmol/L時(shí)，對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響顯著。在Na+濃度一致的條件下，NaCl對(duì)烤煙葉肉細(xì)胞的影響明顯高于Na2SO4，主要表現(xiàn)在對(duì)葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞程度大，且NaCl對(duì)烤煙葉片抗氧化酶平衡系統(tǒng)的影響更大。