夏旭，周雨行，夏金蘭,2，聶珍媛,2，王娜，楊洪英

(1.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙，410083；2.中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室，湖南長沙，410083；3.東北大學(xué)冶金學(xué)院，遼寧沈陽，110819)

微生物厭氧鐵還原是重要的生物地球化學(xué)過程，在鐵的地球化學(xué)循環(huán)中起著重要的作用，與C，N 和S 的生物地球化學(xué)循環(huán)緊密相關(guān)，對礦物的形成與轉(zhuǎn)化、重金屬的遷移與固定及有機(jī)質(zhì)(如有毒含氯化合物等)的分解與轉(zhuǎn)化等有重要意義[1-3]。在異化鐵還原過程中，異化鐵還原菌利用有機(jī)質(zhì)做電子供體，將環(huán)境中的高鐵礦物(水鐵礦、針鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦、施氏礦物和黃鉀鐵礬等)還原，這類反應(yīng)通常在酸性或中性條件下進(jìn)行，但在堿性條件下由于缺少質(zhì)子、耗能較高，導(dǎo)致反應(yīng)難以發(fā)生[4]。FLYNN 等[5]發(fā)現(xiàn)在堿性條件下通過耦聯(lián)微生物元素硫(S0)和硫酸鹽的還原實現(xiàn)針鐵礦的還原。目前針對厭氧酸性和中性條件下，微生物硫酸鹽還原耦合的鐵還原過程研究較多，但針對厭氧堿性條件下相關(guān)研究比較缺乏，有關(guān)微生物元素硫或硫酸鹽的還原對鐵礦物還原過程的介導(dǎo)機(jī)制并不明晰[6]。在還原過程中生成形態(tài)多樣的鐵硫中間體，涉及復(fù)雜的鐵硫形態(tài)轉(zhuǎn)化，且易受環(huán)境條件如氧氣等的影響，用傳統(tǒng)的離位分析技術(shù)難以進(jìn)行準(zhǔn)確測定。X 線吸收近邊結(jié)構(gòu)光譜(XANES)是原位檢測復(fù)雜樣品中元素形態(tài)的有效手段，廣泛應(yīng)用于地質(zhì)、環(huán)境和生物樣品的相關(guān)檢測。為此，本文以水鐵礦、赤鐵礦以及黃鉀鐵礬為對象，利用XANES技術(shù)對鐵礦物還原過程中Fe/S 的形態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)行表征，研究元素硫介導(dǎo)下典型異化鐵還原菌奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanella oneidensisMR-1)對3 種高鐵礦物的還原過程差異，進(jìn)而闡明微生物元素硫還原對鐵還原過程的介導(dǎo)機(jī)制。

1 實驗

1.1 材料和方法

1.1.1 細(xì)菌、培養(yǎng)基和礦物的準(zhǔn)備

本文所用菌株為奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanella oneidensisMR-1)，購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC，菌株編號1A01706)。微生物生長培養(yǎng)基質(zhì)量濃度如下：NaHCO3為2.5 g/L，NH4Cl為0.25 g/L，KCl 為0.1 g/L，NaCl 為0.1 g/L，MgSO4·7H2O為0.05 g/L，MgCl2·6H2O為0.2 g/L，KH2PO4為0.04 g/L，酵母膏為1 g/L。在培養(yǎng)基中加入乙酸鈉(0.01 mol/L)作為電子供體，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶液pH至9.0，最后于115 ℃下高溫滅菌30 min待用。微生物起始接種濃度約為2×108個/mL，接種體積為100 mL，于厭氧培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)?；瘜W(xué)試劑均為分析純或更高。

實驗中使用的水鐵礦、赤鐵礦和元素硫來自Sinopharm 化學(xué)試劑公司，黃鉀鐵礬通過生物合成方法制備[7]：將濃度為3×106個/mL 的Sulfolobus metallicus(由中南大學(xué)生物冶金教育部重點實驗室提供)接入裝有200 mL 基本培養(yǎng)基的錐形瓶中(容量為250 mL)，并加入30 g/L的FeSO4·7H2O，然后在65 ℃，180 r/min 的條件下培養(yǎng)48 h。收集生成的黃鉀鐵礬，并用蒸餾水清洗7次。采用X線衍射(XRD)技術(shù)表征3種鐵礦物樣品。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)和鐵還原實驗

在含有100 mL 培養(yǎng)基的厭氧瓶中(容量為250 mL)，分別加入水鐵礦、赤鐵礦和黃鉀鐵礬至鐵的最終濃度為0.1 mol/L；加0.1 g 硫，加入S.oneidensis至細(xì)菌終濃度為2×108個/mL，在30 ℃下厭氧培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔24 h 取樣，通過顯微鏡檢直接記數(shù)法測定細(xì)胞濃度，通過鄰菲羅啉法的顯色原理，利用紫外可見分光光度計測定Fe2+濃度[8-9]，并通過拍照記錄溶液顏色變化。在采用無菌對照的同時，使用加礦加菌不加硫?qū)嶒灲M作為輔助對照。所有實驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.1.3 鐵硫形態(tài)XANES分析

在上述鐵還原實驗過程中每隔24 h取出0.5 mL懸浮液，以12 000 r/min的速度離心8 min，沉淀用去離子水清洗3次，真空冷凍干燥，將凍干樣品保存在氮氣中直至硫的K邊和鐵的L邊XANES分析。硫的K 邊和鐵的L 邊XANES 分析分別在中國高能物理所的北京同步輻射裝置4B7A 線站(能量范圍是2 100 ～6 000 eV)和4B7B 線站(能量范圍50 ～1 700 eV)完成。4B7A 線站的束線來自電流為100 mA，能量為2.5 GeV 的存儲環(huán)。4B7A 線站光源經(jīng)過Si(111)雙晶體單色儀過濾，在熒光模式下通過Si(Li)檢測器(PGT LS30135)獲得數(shù)據(jù)。硫的K 邊XANES 能量掃描范圍為2 460～2 490 eV，掃描步長0.3 eV。每個樣品檢測時間約為10 min，并根據(jù)ZnSO4光譜中最高共振能量峰(2 480.4 eV)來校準(zhǔn)該X線能量。采用全電子產(chǎn)額模式分析鐵的L邊XANES，能量掃描范圍為690～928 eV，在690～703 eV 范圍內(nèi)，掃描步長為0.5 eV，在703～928 eV范圍內(nèi)，掃描步長為0.1 eV。根據(jù)FeSO4最高共振能量峰(702 eV)和Fe2(SO4)3最高共振能量峰(704 eV)來校準(zhǔn)該X線能量。所有掃描次數(shù)為5次，選取邊后已無結(jié)構(gòu)吸收的直線區(qū)的2 點對XANES譜圖進(jìn)行歸一化處理，并且以最大吸收處的能量進(jìn)行歸一校準(zhǔn)，所用軟件為Origin Pro 8.5 和IFEFFIT[10]。

2 結(jié)果

2.1 3種礦物樣品XRD結(jié)果

水鐵礦、黃鉀鐵礬和赤鐵礦的XRD 結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可見：水鐵礦的結(jié)晶度很小，XRD圖中沒有明顯的尖峰，2個寬峰分別對應(yīng)2-線水鐵礦的(300)和(110)晶面，說明該水鐵礦為典型的2-線水鐵礦[11-12]。由圖1(b)可見：生物合成的黃鉀鐵礬XRD 結(jié)果中衍射特征峰的位置與黃鉀鐵礬標(biāo)準(zhǔn)衍射圖譜(22-0827)所示位置相一致[13]，表明生物合成法獲得的黃鉀鐵礬具有較高的結(jié)晶度，且純度很高。由圖1(c)可見：赤鐵礦的結(jié)晶度很好，通過與α-Fe2O3標(biāo)準(zhǔn)衍射圖譜(79-1741)相比較，各衍射特征峰吻合度高，且沒有出現(xiàn)其他物相的衍射峰，表明赤鐵礦的純度也很高[14]。

2.2 生長曲線、Fe2+質(zhì)量濃度和溶液顏色變化

在微生物硫還原介導(dǎo)下，鐵礦物還原過程中的細(xì)菌濃度、Fe2+質(zhì)量濃度和顏色變化分別如圖2～4 所示。由圖2可見：細(xì)菌濃度在第7 天達(dá)到最大濃度，之后開始下降。由圖3可見：在未加元素硫時，3 種礦物的生物還原過程中Fe2+質(zhì)量濃度增長緩慢，其中，黃鉀鐵礬和水鐵礦中Fe2+質(zhì)量濃度比赤鐵礦中的高；在加有元素硫時，溶液中Fe2+質(zhì)量濃度明顯增加，其中黃鉀鐵礬中Fe2+質(zhì)量濃度的增長速度明顯高于水鐵礦和赤鐵礦質(zhì)量濃度的增長速度，在第7 天時黃鉀鐵礬中Fe2+質(zhì)量濃度提高近6.8 倍,在水鐵礦中提高近3.0 倍，而在赤鐵礦中提高近1.7 倍。由圖4可見：24 h 時，無菌對照組溶液顏色(A7，B7，C7)基本不發(fā)生變化，有菌體系(A8，B8，C8 和A9，B9，C9)中顏色均發(fā)生變化；進(jìn)一步比較2組有菌體系的顏色變化，發(fā)現(xiàn)添加元素硫的實驗組(A6，B6，C6 和A9，B9，C9)有黑色沉淀生成，且溶液顏色變化比未添加元素硫的對照組(A5，B5，C5和A8，B8，C8)明顯加快。

圖1 3種高鐵礦XRD譜Fig.1 XRD patterns of three ferric minerals

2.3 鐵還原過程中沉淀物的硫的K-邊和鐵的L-邊XANES光譜分析

圖2 不同實驗體系中S.oneidensis的生長曲線Fig.2 Growth curves ofS.oneidensis in different experiments

圖3 不同實驗體系中Fe2+濃度的變化Fig.3 Concentration of Fe2+in different experiments

圖4 不同實驗體系中溶液顏色變化Fig.4 Color variation in different experiments

為進(jìn)一步研究微生物硫還原介導(dǎo)下鐵礦物還原過程中Fe/S 形態(tài)轉(zhuǎn)化和黑色沉淀物形態(tài)，利用硫的K-邊和鐵的L-邊XANES光表征不同鐵礦物還原過程中Fe和S形態(tài)。圖5所示為不同實驗體系中沉積物的硫的K-邊XANES圖。由圖5可見：在加硫的3種礦物實驗體系中，均在2 472 eV處出現(xiàn)了較強(qiáng)的元素硫特征吸收峰[15]，而2 469 eV處對應(yīng)的硫化物特征吸收峰[5,16]則表現(xiàn)出較大差異；水鐵礦加硫?qū)嶒灲M在96 h 后出現(xiàn)不斷增強(qiáng)的硫化物特征吸收峰；赤鐵礦加硫?qū)嶒灲M直到192 h時才出現(xiàn)非常微弱的硫化物特征吸收峰，而黃鉀鐵礬加硫?qū)嶒灲M在24 h 后開始出現(xiàn)不斷增強(qiáng)的硫化物特征吸收峰，并且在2 482.8 eV處一直存在較強(qiáng)的硫酸鹽特征吸收峰[15]。這說明黃鉀鐵礬的鐵還原速率最快，但其結(jié)構(gòu)并沒有被破壞，而赤鐵礦基本沒有被還原。為進(jìn)一步檢測硫化物的組成，對沉淀物進(jìn)行了鐵的L-邊XANES 光譜分析。圖6所示為不同實驗體系中沉積物的鐵的L-邊XANES結(jié)果。由圖6可見：在704 eV 和706 eV 分別出現(xiàn)Fe2+和Fe3+的L3-邊特征吸收峰，但不同實驗體系中Fe2+和Fe3+的L3-邊吸收峰的強(qiáng)度差別比較大。赤鐵礦加硫?qū)嶒灲M中Fe2+和Fe3+特征吸收峰的強(qiáng)度基本不變，黃鉀鐵礬加硫?qū)嶒灲M和水鐵礦加硫?qū)嶒灲M分別在12 h和48 h后Fe2+L3-邊吸收峰越來越高，表明Fe3+逐漸還原為Fe2+，96 h后水鐵礦加硫?qū)嶒灲M的Fe2+L3-邊吸收峰明顯高于黃鉀鐵礬加硫?qū)嶒灲M。進(jìn)一步說明赤鐵礦基本沒有發(fā)生Fe3+還原，黃鉀鐵礬的鐵還原速度較快，水鐵礦的鐵還原程度較大，產(chǎn)物均為FeS類似物[17]。

圖5 不同實驗體系中沉淀物的硫K-邊XANES圖Fig.5 S K-edge XANES spectra of precipitates in different experiments

圖6 不同實驗體系中沉淀物的鐵L-邊XANES圖Fig.6 Fe L-edge XANES spectra of precipitates in different experiments

3 討論

微生物硫還原介導(dǎo)的鐵還原過程在自然界中C，N 和S 等元素循環(huán)及有害的重金屬遷移與轉(zhuǎn)化中有重要作用[18-19]。水鐵礦、赤鐵礦和黃鉀鐵礬是自然界中重要的高鐵礦物，圖1表明3種鐵礦物在結(jié)構(gòu)上有顯著差異，赤鐵礦和黃鉀鐵礬具有較高的結(jié)晶度，而水鐵礦結(jié)晶程度較差。以乙酸鈉為能源底物，S.oneidensis在含3 種鐵礦物的培養(yǎng)基生長時，其鐵還原過程如式(1)所示。進(jìn)一步跟蹤溶液中Fe2+的質(zhì)量濃度和顏色變化發(fā)現(xiàn)，元素硫的加入可明顯提高溶液中Fe2+質(zhì)量濃度，同時溶液顏色變得更深，結(jié)合硫的K-邊XANES 和鐵L-邊XANES 結(jié)果表明溶液顏色加深的原因是在還原過程中生成了FeS類似物的黑色沉淀。這些過程如式(2)～(4)所示[5]。

在高鐵礦物還原形成黑色沉淀過程中，加硫的黃鉀鐵礬和水鐵礦實驗組的變化尤為明顯，赤鐵礦加硫?qū)嶒灲M變化有限，未加硫礦物實驗組沒有明顯變化。這些結(jié)果表明：在堿性條件下，S.oneidensis對高鐵礦物的還原作用較弱，但這種作用受到元素硫生物還原的促進(jìn)，其促進(jìn)機(jī)理可用式(3)和(4)解釋，即微生物硫還原形成的HS-通過化學(xué)作用將高鐵礦物還原，形成Fe2+和元素硫(式(3))，F(xiàn)e2+與HS-形成沉淀(式(4))并與元素硫的生物還原(式(2))相耦合進(jìn)一步促進(jìn)礦物的溶解。3種礦物結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了元素硫生物還原過程形成的HS-對其促進(jìn)作用的差異，其中生物合成的黃鉀鐵礬由于結(jié)構(gòu)較疏松最容易被HS-還原，水鐵礦結(jié)晶度較低，結(jié)構(gòu)容易被破壞，HS-還原程度最大，赤鐵礦結(jié)晶度高，結(jié)構(gòu)致密，最難被HS-還原，說明在堿性條件下，元素硫生物還原介導(dǎo)的高鐵礦物還原過程與礦物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。值得注意的是，新生成的FeS類礦物具有較強(qiáng)的表面活性，能有效吸附環(huán)境中重金屬及加速降解芳香類有機(jī)污染物[6]。在元素硫生物還原介導(dǎo)下，黃鉀鐵礬和水鐵礦容易被還原，F(xiàn)eS形成速率較快，意味著其在重金屬吸附和芳香類有機(jī)污染物降解有較高的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

1)在堿性條件下，元素硫的加入可以明顯提高S.oneidensis對水鐵礦、赤鐵礦和黃鉀鐵礬的鐵還原效率，并形成FeS類似物黑色沉淀。

2)硫生物還原介導(dǎo)下的3種高鐵礦物還原有明顯的差異，黃鉀鐵礬結(jié)構(gòu)疏松，最容易被還原；水鐵礦結(jié)晶度較低，結(jié)構(gòu)容易被破壞，還原程度最大；赤鐵礦結(jié)晶度高，結(jié)構(gòu)致密，最難被還原。