張玉虹 孫喜斌 李立楠 康燕華 石克威 馬會 于治芳 陳江平

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（河北張家口075000）

我國是子宮內(nèi)膜癌的高發(fā)地區(qū)，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制及生物學(xué)行為特點的研究一直是腫瘤醫(yī)學(xué)的熱點［1］。根據(jù)中國癌癥中心最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌已成為我國發(fā)病率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一［2］，但是由于其病灶多局限于子宮體，生長和轉(zhuǎn)移速度較慢，多數(shù)早期患者預(yù)后良好，5年生存率超過70%［3］。因此大力開展子宮內(nèi)膜癌篩查工作，對于患者的早期確診以及個體化治療具有重要的臨床價值。但是目前國內(nèi)外對于子宮內(nèi)膜癌的篩查方面尚未形成健全的篩查理念和成熟的篩查手段，在高危人群中進行選擇性篩查更適合我國目前的國情［4］。除了肥胖、高血壓、糖尿病、多囊卵巢綜合癥等高危因素［5］以外，從子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制出發(fā)尋找有效的生物標志分子也是醫(yī)學(xué)工作者研究工作的重點。2004年，CALIN 等［6］首次證實一半以上的miRNA 位于染色體脆性位點，并且與眾多已知的原癌基因和抑癌基因的表達密切相關(guān)。血清miRNAs 已成為新一代最有潛力的診斷和預(yù)后生物標志物之一。KONG 等［7］和李萬斌等［8］都曾通過細胞學(xué)實驗證實miR-195 可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但是其作為子宮內(nèi)膜癌診斷和預(yù)后生物標志物的潛力尚未見有學(xué)者關(guān)注。因此，本研究通過檢測miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者外周血和腫瘤組織中的表達水平，以及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，旨在證實血清miR-195 成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷指標和預(yù)后判斷分子的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年1月至2017年1月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除獲取的子宮內(nèi)膜癌以及相配對的癌旁組織標本120 例，術(shù)后經(jīng)病理證實均為子宮內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜癌組按照病理類型：內(nèi)膜樣腺癌61 例，漿液性癌34 例，透明細胞癌16 例，特殊病理類型9 例（黏液性腺癌4例、未分化癌3 例、鱗癌1 例、小細胞癌1 例）。同時采集所有患者術(shù)前外周血液樣本?；颊吣挲g35 ～67 歲，平均（51.25 ± 8.36）歲。納入標準：所有患者均為原發(fā)灶，首次切除；術(shù)前未接受過放療、化療、內(nèi)分泌治療等相關(guān)抗腫瘤治療；臨床病理資料完整；腫瘤組織與癌旁組織距離≥3 cm；手術(shù)方式為子宮內(nèi)膜癌分期手術(shù)（廣泛子宮切除術(shù)、雙附件切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)）。排除其他婦科疾病、急慢性炎癥、免疫系統(tǒng)疾病者。另隨機選取同時期因子宮肌瘤在本院行手術(shù)切除，經(jīng)術(shù)后病理證實是正常子宮內(nèi)膜的患者術(shù)前血液樣本60 例，患者年齡25 ～71 歲，平均（53.98 ± 9.44）歲；健康體檢合格者60 例，患者年齡24 ～78 歲，平均（53.47±10.21）歲。子宮肌瘤患者的納入標準：首次子宮手術(shù)，臨床病理資料完整者。排除合并惡性腫瘤、急慢性炎癥、免疫系統(tǒng)疾病者。兩組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有組織標本均在離體后30 min 內(nèi)取得，經(jīng)生理鹽水清洗后迅速放入液氮中，2 d 內(nèi)移至-80 ℃冰箱中保存。本項研究已獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準（倫理批號：20120118-02）。在采集患者血液樣本或病理組織標本前以書面形式告知受試對象或家屬研究的目的及風險，并由患者或家屬簽署書面知情同意書。

1.2 血漿和組織樣本總RNA提取及實時熒光定量PCREDTA 抗凝管采集外周血4 mL，3 500 r/min離心10 min 至凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血液樣本采用miRNeasy Serum/Plasma Kit（大連TAKARA）提取血漿總RNA。另取組織標本100 mg，采用TRIzol 試劑（美國SIGMA）提取組織總RNA。采用紫外分光光度計檢測RNA 濃度（OD260nm/OD280nm在1.8 ～2.1 之間則提取的RNA 合格）。取2 μL RNA為模板，根據(jù)SuperScript RT kit（大連TAKARA）說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取50 μg cDNA 為模板，按照miScript SYBR Green PCR master Mix（大連TAKARA）說明書進行PCR。冰浴中配制20 μL PCR 反應(yīng)體系，PCR 擴增參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性10 min，36個循環(huán)（95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s），生成溶解曲線并分析。miR-195引 物 序 列（F：5′-GTATTCGCACTGGATACGACCGACC-3′，R：5′-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3′）；內(nèi)參小分子U6 引物序列（F：5′-CAGCAAACC AACAATGCCGA-3′；R：5′-GATCTGCGACCACAC CATGA-3′）。以2-ΔΔCt表示miR-195 相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法IBM SPSS Statistics 17.0 軟件和Graphpad Prism6 軟件用于資料處理，miR-195 在血漿和組織中的表達量符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示；子宮內(nèi)膜癌患者血漿和子宮肌瘤患者血漿miR-195 表達量以獨立樣本t檢驗；癌組織和癌旁組織miR-195 表達量的差異采用配對樣本t檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算血漿miR-195 診斷子宮內(nèi)膜癌的曲線下面積（area under curve，AUC）。子宮內(nèi)膜患者血漿和取子宮內(nèi)膜癌患者血漿或癌組織miR-195 表達的中位數(shù)，＞中位數(shù)則為高表達，≤中位數(shù)則為低表達。血漿miR-195 表達與患者病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗。術(shù)后無復(fù)發(fā)生存分析用Kaplan-Meier 法并行Log-rank 檢驗。采用Cox 比例風險回歸模型分析子宮內(nèi)膜癌患者總生存期的危險因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜患者癌組織和癌旁組織miR-195 表達量比較癌組織中miR-195 表達量為（0.871 ±0.141），低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.996，P＜0.05）。子宮內(nèi)膜癌組織中miR-195 中位表達值為0.886（圖1）。

圖1 qRT-PCR 法檢測miR-195 在子宮內(nèi)膜癌組織和相配對的癌旁組織中的表達差異Fig.1 Difference of miR-195 expression in endometrial carcinoma tissues and adjacent tumor tissues

2.2 子宮內(nèi)膜患者、子宮肌瘤患者和健康者血漿miR-195 表達量比較子宮內(nèi)膜癌患者血漿miR-195表達量為（0.689±0.247），低于子宮肌瘤患者和健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 8.996，P＜0.05）。子宮內(nèi)膜癌患者血漿中miR-195 中位表達值為0.715（圖2）。

圖2 qRT-PCR 法檢測miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者、子宮肌瘤患者和健康者中的表達差異Fig.2 Difference of plasma miR-195 expression in endometrial carcinoma patients，hysteromyoma patients and healthy volunteers

2.3 ROC 曲線分析血漿miR-195 對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值經(jīng)ROC 曲線分析，血漿miR-195 表達量對子宮內(nèi)膜癌診斷的AUC 為0.732（95%CI：0.611 ～0.853），敏感度和特異度分別為71.5%和69.0%，約登指數(shù)為0.405。見圖3。

圖3 血漿miR-195 表達對診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC 曲線圖Fig.3 ROC curve analysis of the diagnostic potential of plasma miR-195 expression on endometrial carcinoma

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)miR-195 在子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 的中位表達量，60 例患者呈高表達，60 例患者呈低表達。組織miR-195 表達量與腫瘤分化程度、FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度有關(guān)（P＜0.05），但是與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病灶形態(tài)無關(guān)（P＞0.05）。血漿miR-195 表達量與FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度有關(guān)（P＜0.05），但是與年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病灶形態(tài)無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.5 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達與預(yù)后的關(guān)系對120 例患者進行隨訪19 ～87 個月，平均生存時間為57 個月，29 例患者死亡，病死率為22.5%。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，組織miR-195 高表達亞組死亡7 例，低于miR-195 低表達者（Log-rank χ2= 6.964，P= 0.008）。血漿miR-195 高表達亞組死亡9 例，低于miR-195 低表達者，有統(tǒng)計學(xué)差異（Log-rank χ2= 3.195，P= 0.047）。見圖4。

2.6 單因素和多因素COX 風險回歸分析子宮內(nèi)膜癌患者生存期的影響因素以患者術(shù)后死亡作為因變量（死亡賦值為1，生存賦值為0），經(jīng)單因素和多因素COX 風險回歸模型分析，F(xiàn)IGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血漿和組織miR-195 表達量與子宮內(nèi)膜癌患者總生存期相關(guān)，是影響子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后生存的獨立預(yù)測因素（P＜0.05）。見表2。

表1 子宮內(nèi)膜癌組織和血漿中miR-195 表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between expression of miR-195 expression and clinicopathological parameters

圖4 子宮內(nèi)膜癌患者隨訪期間Kaplan-Meier 生存曲線Fig.4 Kaplan-Meier survival curve of endometrial carcinoma patients during followed up

3 討論

最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌已經(jīng)成為我國發(fā)病率最高的女性生殖道惡性腫瘤，并呈年輕化趨勢，一方面與環(huán)境、飲食、社會壓力等因素有關(guān)，另一方面是因為我國近些年對子宮內(nèi)膜癌篩查工作的重視以及診斷技術(shù)不斷更新。但是由于篩查技術(shù)尚不成熟，而且缺乏大規(guī)模研究證實普遍篩查的經(jīng)濟學(xué)效益，因此，對于子宮內(nèi)膜癌的篩查理念尚未形成國際統(tǒng)一的標準［9］?？紤]到我國的基本國情，更傾向于對高危因素人群進行選擇性篩查，例如子宮內(nèi)膜癌“三聯(lián)征”-肥胖、糖尿病、高血壓患者。MATSUO 等［10］、石婭婭等［11］都曾進行Meta 分析，證實胰島素抵抗可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，是引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的重要病理基礎(chǔ)，因此胰島素抵抗、代謝異常、合并卵巢綜合征等都是引發(fā)子宮內(nèi)膜癌的高危因素之一。此外，根據(jù)2015年美國癌癥協(xié)會指南推薦，對于高齡、無抵抗雌激素治療、不孕不育等患者建議在專業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下進行子宮內(nèi)膜癌細胞學(xué)檢查［12］。但是僅依靠高危因素作為選擇性篩查的判斷標準具有極大的主觀性，尋找重復(fù)性高，對篩查、診斷、治療和預(yù)后有指導(dǎo)意義的分子生物學(xué)標志物成為近年的探究熱點。但是由于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機制復(fù)雜且尚不明確，為分子標志物的尋找?guī)砹艘欢ǖ睦щy。

表2 影響子宮內(nèi)膜癌患者總生存期的單因素和多因素COX 風險回歸模型分析Tab.2 Univariate and multivarable COX regression analyses of actors predictive of poor overall survival in endometrial carcinoma patients

MiRNAs 與腫瘤的關(guān)系毋庸置疑，而且眾多研究已證實血miRNAs 是目前腫瘤診斷和預(yù)后方面最有潛力、且最有望用于臨床的生物學(xué)標志分子。TSUKAMOTO 等［13］通過高通量miRNAs 芯片技術(shù)，篩選出在子宮內(nèi)膜癌患者血液和組織中呈差異性表達的miRNAs 譜，其中miR-195 表達明顯降低。此外，ZHENG 等［14］、LI 等［15］學(xué)者也證實miR-195 在非小細胞肺癌、膀胱癌等發(fā)生、發(fā)展過程中屬于抑癌基因，表達量下調(diào)。但是miR-195 在子宮內(nèi)膜癌中是否也屬于功能性基因尚未見有研究證實。

本研究基于我院前期建立的長期隨訪數(shù)據(jù)庫，選擇了符合納入標準的120 例子宮內(nèi)膜癌患者的組織標本和血液樣本，并在研究前確定了患者或家屬的入組意愿。經(jīng)檢測，筆者發(fā)現(xiàn)miR-195在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織。另外，為了進行對照性研究，筆者還采集了因子宮肌瘤在本院行全子宮切除術(shù)，經(jīng)術(shù)后病理證實是正常子宮內(nèi)膜的患者術(shù)前血液樣本60 例以及健康體格檢查正常的志愿者血液樣本60 例，與子宮內(nèi)膜癌患者的血液樣本同時進行對比研究。結(jié)果顯示，血漿miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達量明顯較子宮內(nèi)膜正常的兩組對照組血液樣本降低，并且經(jīng)ROC 分析，血漿miR-195 可用于子宮內(nèi)膜癌的診斷。

在此基礎(chǔ)上，筆者進一步結(jié)合子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理資料來分析miR-195 表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果顯示組織miR-195 表達量與腫瘤分化程度、FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度有關(guān)，而血漿miR-195 表達量與FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度有關(guān)。20 世紀80年代，Bokhman 首次將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型為雌激素依賴性低級別子宮內(nèi)膜癌，Ⅱ型為非子宮內(nèi)膜樣癌（主要包括漿液性癌和透明細胞癌），與雌激素無關(guān)［16］。在本研究中，組織miR-195 在Ⅰ型患者中的表達量相對較Ⅱ型患者高，說明miR-195 可能與雌激素調(diào)節(jié)或者雌激素受體的表達有關(guān)，具體的作用機制需要進一步細胞學(xué)實驗進行證實。但是血漿miR-195 未發(fā)現(xiàn)與患者發(fā)病類型有關(guān)，說明組織和血漿miRNAs 的表達譜可能存在一定的差異性。相較于血漿miRNAs，組織miRNAs 與患者病理特征的關(guān)系更明顯，但是由于取材困難，用于臨床檢測有一定的困難，而血液樣本取材方便，操作簡便，miRNAs 表達穩(wěn)定性良好，更適合用于臨床檢驗［17］。而且筆者通過COX 風險比例回歸模型分析，組織miR-195 和血漿miR-195 都是影響子宮內(nèi)膜癌術(shù)后生存的獨立因素。

綜上所述，miR-195 在子宮內(nèi)膜癌患者血漿中的表達量較子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能正常者明顯下調(diào)，且在癌組織中的表達量也明顯低于癌旁組織，可見miR-195 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有類似抑癌基因的活性。而且在各種病理參數(shù)和預(yù)后研究中，血漿miR-195 與患者FIGO 分期、發(fā)病類型、浸潤深度、術(shù)后生存期均密切相關(guān)，因此血漿miR-195 有望成為子宮內(nèi)膜癌輔助診斷和預(yù)后的敏感分子標志物，但是若應(yīng)用于臨床，尚需更大樣本的數(shù)據(jù)分析。另外，目前關(guān)于miRNAs 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚不明確，也是阻礙miRNAs 成為新的生物學(xué)診斷分子的關(guān)鍵問題之一，因此更深入的研究miR-195 對子宮內(nèi)膜癌細胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用和分子機制是下一步的工作重點之一。