蘇琪盛 張里謙 黎小紅 羅玉珍 覃柳群 丘玉鈴 楊崢 莫武寧

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（南寧530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源 于鼻咽部上皮細(xì)胞，是我國(guó)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國(guó)南方地區(qū)居世界首位［1-2］。鼻咽癌起病隱匿，病情進(jìn)展迅速，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前，放射治療是鼻咽癌的主要治療方法，然而晚期患者治療效果不佳，許多患者治療后易出現(xiàn)放療抵抗和發(fā)生局部復(fù)發(fā)，因此鼻咽癌的治療仍具有挑戰(zhàn)性［3-5］。早期診斷可使患者得到更及時(shí)和更高效的治療。為此，篩選鼻咽癌早期診斷的生物標(biāo)志物，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

NUAK1（NUAK family kinase 1），又名ARK5，作為人腺苷單磷酸（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）家族成員之一，是AKT 的下游信號(hào)分子［6］。AKT在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等多種影響到腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要作用［7］。據(jù)報(bào)道，NUAK1 在體內(nèi)參與多種生理病理過程，如促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，調(diào)控血管生成等，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。NUAK1 在部分腫瘤如乳腺癌［9］、肝癌［10］、胰腺癌［11］等組織中高表達(dá)，并且在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用。但是，NUAK1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況以及NUAK1 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響尚未明確。本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織中NUAK1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)NUAK1 的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征之間進(jìn)行相關(guān)性分析。進(jìn)一步沉默鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HK1 中NUAK1 的表達(dá)，觀察NUAK1 表達(dá)下調(diào)的CNE2、HK1 細(xì)胞株中遷移和侵襲能力的變化，探討NUAK1 與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織和細(xì)胞用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增的16 例鼻咽癌和16 例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本獲取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科。在16 例鼻咽癌患者組織標(biāo)本中男13 例，女3 例，年齡分布范圍為32 ～78 歲，中位年齡51 歲。在16 例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本中，男10 例，女6 例，年齡分布范圍為25 ～77 歲，中位年齡44 歲。

用于本次研究中免疫組織化學(xué)染色的組織標(biāo)本石蠟切片獲取自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科。包含88 例鼻咽癌組織樣本及30 例鼻咽黏膜慢性炎樣本，在88 例鼻咽癌組織標(biāo)本石蠟切片中男63 例，女25 例，年齡分布范圍為16 ～71 歲，中位年齡47 歲；切片樣本病理類型：非角化型未分化性癌77 例，非角化型分化性癌11 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7 例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）2010年制定的鼻咽癌分期法進(jìn)行分期：Ⅰ和Ⅱ期共計(jì)11 例，Ⅲ和Ⅳ期共計(jì)77 例；腫瘤病理分期：T1、T2期21 例，T3、T4期67 例。在30 例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本中男23 例，女7 例，年齡18 ～69 歲，中位年齡44 歲。以上所有患者均未經(jīng)過放療和化療。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得受試者知情同意。

本次研究以鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HK1 為研究對(duì)象，這兩株細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予本課題組。將CNE2 和HK1 細(xì)胞株在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑siRNA-NUAK1（序列：AGAGAGAATCAGGTTACTA）和siRNA CON054 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司?？俁NA 提取試劑RNAiso Plus reagent，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit，熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自日本TaKaRa 公司?？筃UAK1 抗體（ab37641）購(gòu)于美國(guó)abcam 公司，兔鼠通用型SP-9002 試劑盒和DAB 顯色液購(gòu)于北京中杉金橋公司，抗GAPDH 抗體（2118S）和熒光二抗（5151P）購(gòu)于CST 公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰酶消化液購(gòu)自Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自LONSERA公司，青霉素-鏈霉素混合溶液、嘌呤霉素、RIPA蛋白裂解液等購(gòu)自北京索萊寶公司。Transwell 小室和24 孔板等購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 篩選差異表達(dá)基因從oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.oncomine.org）中獲取包含31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數(shù)據(jù)GSE12452（GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。對(duì)全部基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異表達(dá)倍數(shù)（Fold Change）≥2 且P＜0.05。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)NUAK1 mRNA 表達(dá)按照RNAiso Plus reagent 操作說明使用Trizol 法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，無酶水溶解沉淀。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit 將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并按照熒光定量PCR 試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，引物購(gòu)自上海擎科公司，目的基因NUAK1 和內(nèi)參基因GAPDH 引物序列及擴(kuò)增片段大小見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NUAK1 蛋白表達(dá)采用免疫組化SP 法，將免疫組化切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精逐級(jí)水化，隨后檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）高溫高壓修復(fù)抗原。一抗NUAK1 濃度為1∶100，切片置于4 ℃過夜，按照試劑盒說明書操作。DAB顯色后蘇木素復(fù)染，每張切片均隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野（400×）進(jìn)行觀察。每張切片經(jīng)過兩名研究人員進(jìn)行評(píng)分。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段大小Tab.1 Primer sequence and amplified fragment size

NUAK1 陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒。在視野下計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，以細(xì)胞漿中出現(xiàn)淺黃、棕黃或棕褐色的細(xì)小顆粒為陽(yáng)性細(xì)染色為主要判定標(biāo)準(zhǔn)。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱：0 分（無陽(yáng)性著色）、1 分（淺黃色）、2 分（棕黃色）、3 分（棕褐色）。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：1 分（＜10%）、2 分（10%～50%）、3 分（50%～75%），4 分（＞75%）。兩項(xiàng)乘積≥6 分為高表達(dá)，≤4 分為低表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的CNE2、HK1 細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染siRNA-NUAK1 的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空載片段siRNA CON054 的細(xì)胞株為空載組，分別將含有NUAK1 基因片段和空載片段的慢病毒轉(zhuǎn)染至CNE2、HK1細(xì)胞株中。轉(zhuǎn)染72 h后，各轉(zhuǎn)染組用含2 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。提取mRNA，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)siRNANUAK1 干擾效果。

1.2.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將底部膜含8 μm大小孔隙的小室置于24 孔板上，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基。分別將含4×104個(gè)實(shí)驗(yàn)組和空載組細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液加入上室，培養(yǎng)24 h 后取出小室，4%多聚甲醇固定細(xì)胞30 min，1%結(jié)晶紫染液染色20 min。室溫下晾干小室，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在小室內(nèi)加入100 μL 適當(dāng)濃度的Matrigel，4 h 待稀釋后的Matrigel 變成固態(tài)后，下室和上室分別加入500 μL 含有10%血清的完全培養(yǎng)基和4×104個(gè)實(shí)驗(yàn)組和空載組細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后取出小室，固定，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)數(shù)資料之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NUAK1 在鼻咽癌芯片中高表達(dá)在31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數(shù)據(jù)中，NUAK1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)高于正常鼻咽組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 NUAK1 在鼻咽癌和正常鼻咽組織的表達(dá)（oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)）Fig.1 Expression of NUAK1 in nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharyngeal tissue（oncomine database）

2.2 NUAK1 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)qRTPCR 結(jié)果顯示在16 例鼻咽癌和16 例鼻咽黏膜慢性炎組織中NUAK1 mRNA 的表達(dá)水平分別為（2.52 ± 1.61）和（1.31 ± 0.78）。鼻咽癌組織中NUAK1 mRNA 的表達(dá)量明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 NUAK1 mRNA 在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of NUAK1 mRNA in nasopharyngeal carcinoma and chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa

2.3 NUAK1蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)在88例鼻咽癌及30 例鼻咽黏膜慢性炎組織標(biāo)本石蠟切片中，免疫組化結(jié)果顯示NUAK1 蛋白在52 例鼻咽癌組織中高表達(dá)，在36 例鼻咽癌組織中低表達(dá)；NUAK1 蛋白在8 例鼻咽黏膜慢性炎組織中高表達(dá)，在22 例鼻咽黏膜慢性炎組織中低表達(dá)。鼻咽癌組織的NUAK1 蛋白表達(dá)率明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）。見圖3。另外，鼻咽癌中NUAK1 蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、T 分期、臨床分期等無相關(guān)（P＞0.05），見表2。

圖3 NUAK1 蛋白在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織中的表達(dá)（免疫組化，400×）Fig.3 Expression of NUAK1 protein in nasopharyngeal carcinoma and chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa（immunohistochemistry，400×）

2.4 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中NUAK1 表達(dá)下降應(yīng)用qRTPCR 檢測(cè)NUAK1 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示：CNE2細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組和空載組的NUAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.17 ± 0.01）、（1.00 ± 0.02），實(shí)驗(yàn)組CNE2 細(xì)胞NUAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于空載組（P＜0.01）；HK1 細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組和空載組的NUAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.06 ± 0.01）、（1.00±0.01），實(shí)驗(yàn)組HK1 細(xì)胞NUAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯低于空載組（P＜0.001），表明siRNANUAK1 CNE2 細(xì)胞和HK1 細(xì)胞均構(gòu)建成功。見圖4。

2.5 沉默NUAK1 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HK1 遷移和侵襲能力的影響Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默NUAK1后CNE2、HK1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（176.40±9.76）、（99.00±7.62）個(gè)，CNE2、HK1 細(xì)胞空載組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（233.20 ±6.25）、（186.20 ± 5.91）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于空載組（P＜0.05），提示沉默NUAK1 后鼻咽癌細(xì)胞CNE2、HK1 遷移能力減弱，見圖5。

表2 NUAK1 蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系Tab.2 Relationship between NUAK1 protein expression and clinicopathological indexes of nasopharyngeal carcinoma 例

圖4 NUAK1 mRNA 在不同細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of NUAK1 mRNA in different cells

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默NUAK1 后CNE2、HK1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（24.20± 2.92）、（54.00 ± 8.62）個(gè)，CNE2、HK1 細(xì)胞空載組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（93.00 ± 3.54）、（173.60 ± 9.32）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于空載組（P＜0.05），提示沉默NUAK1 后鼻咽癌細(xì)胞CNE2、HK1侵襲能力減弱，見圖6。

圖5 沉默NUAK1 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2、HK1 遷移能力的影響（24 h，200×）Fig.5 Effect of NUAK1 silencing on CNE2 and HK1 migration of nasopharyngeal carcinoma cells（24 h，200×）

圖6 沉默NUAK1 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2、HK1 侵襲能力的影響（24 h，100×）Fig.6 Effect of NUAK1 silencing on CNE2 and HK1 invasion ability of nasopharyngeal carcinoma cells（24 h，100×）

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多因子參與的復(fù)雜過程，而腫瘤的惡性程度與其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)。據(jù)報(bào)道，AKT 在促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要作用［7］，AKT/NUAK1 通路是決定腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵腫瘤侵襲相關(guān)因子之一［8］。近年來，越來越多的證據(jù)表明NUAK1 在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用。HUANG 等［11］報(bào)道NUAK1 蛋白表達(dá)在10 對(duì)人胰腺癌組織高于相應(yīng)的相鄰正常組織，并且促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。CHANG 等［12］研究得出在AKT 的調(diào)控下，ARK5 可能通過MMP2、MMP9 的激活增強(qiáng)了乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。CHEN 等［13］研究表明NUAK1 表達(dá)與胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移和患者生存密切相關(guān)，可能通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）改變參與胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。眾所周知，EMT 指上皮細(xì)胞在特定的生理或病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。在鼻咽癌中，多種抑癌或促癌的基因或者非編碼RNA 已被報(bào)道通過EMT 途徑參與到鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展之中，如鈣網(wǎng)蛋白通過誘導(dǎo)細(xì)胞EMT 促進(jìn)鼻咽癌遷移和侵襲［14］、miR-124則可能通過Akt 信號(hào)通路抑制鼻咽癌細(xì)胞株EMT，并增加鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性［15］。然而，目前NUAK1 基因?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的生物學(xué)功能的影響尚未見報(bào)道，NUAK1 在鼻咽癌中的作用是否與EMT相關(guān)尚未明確，因此這將是筆者下一步研究的重點(diǎn)。

本研究首先從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NUAK1 基因在鼻咽癌的表達(dá)是正常鼻咽組織的2.18 倍。在侵襲能力較高的頭頸部癌癥中，NUAK1 已被證實(shí)與頭頸部癌癥的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16］。LIU 等［17］也用免疫組化方法驗(yàn)證了NUAK1 蛋白在鼻咽癌中高表達(dá)，并且高NUAK1表達(dá)與鼻咽癌的預(yù)后不良相關(guān)。進(jìn)一步收集人鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織，通過qRT-PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)NUAK1 mRNA 在鼻咽癌中高表達(dá)，免疫組化方法驗(yàn)證了NUAK1 蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)高于鼻咽黏膜慢性炎，并且NUAK1 蛋白的表達(dá)與鼻咽癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)。筆者推測(cè)NUAK1 是鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，可能作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的靶向治療。

腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力是腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要因素，是許多惡性腫瘤患者死亡的主要原因。為了更好地了解NUAK1 基因可能在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用，本研究設(shè)計(jì)了siRNA-NUAK1，沉默NUAK1 在鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HK1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NUAK1 表達(dá)下調(diào)的CNE2、HK1細(xì)胞株中遷移和侵襲能力均下調(diào)，說明NUAK1 基因在鼻咽癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮正向調(diào)控作用。然而，NUAK1 如何影響鼻咽癌細(xì)胞的遷移與侵襲的機(jī)制尚未明確。腫瘤細(xì)胞的EMT 使其獲得侵襲和遷移能力，激活腫瘤細(xì)胞EMT 發(fā)生的分子機(jī)制是目前研究腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)［18-19］。近年來的研究表明在胃癌、頭頸部癌癥中，NUAK1 誘導(dǎo)EMT 有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［13，15］。因此，筆者推測(cè)NUAK1 與EMT 在鼻咽癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中也存在一定的關(guān)系，這有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NUAK1 基因在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過siRNA 技術(shù)干擾NUAK1 的表達(dá)可以顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示NUAK1 可能是一種與鼻咽癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)的分子標(biāo)志物，但NUAK1 對(duì)抑制鼻咽癌進(jìn)展的分子機(jī)制及其臨床應(yīng)用價(jià)值尚未明確，有待后續(xù)深入研究。