鄭劍霄 郭偉偉 李清娟 郭婭妮 魏球娣 易夢(mèng)婷 王蘇美 李工

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院（廣州510120）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的首要疾?。?-2］。肺癌的治療預(yù)后欠佳，患者的5年生存率只有約15%［3-4］。肺癌中約80%為非小細(xì)胞肺癌，大部分患者確診時(shí)已發(fā)展為中晚期［5］。目前，放療聯(lián)合化療的綜合治療是不可手術(shù)非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療［6］，尤其適合于體力狀態(tài)較好，能耐受毒副反應(yīng)的患者［7］。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)放療抵抗導(dǎo)致局部治療失?。?-9］，因此，提高肺癌細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性是改善不可手術(shù)局部晚期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要途徑。復(fù)方苦參注射液是一種具有廣譜抗腫瘤作用的中藥制劑［10-11］，臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)肺癌放射治療療效的作用［12］，但目前有關(guān)復(fù)方苦參注射液在肺癌放療增敏方面的基礎(chǔ)研究較少，為此，在細(xì)胞水平上進(jìn)行這方面研究，旨在今后為其應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑復(fù)方苦參注射液（國藥準(zhǔn)字Z14021231），由山西振東制藥股份有限公司生產(chǎn)，100 mL 含生藥40g ；胰酶（貨號(hào)：25200-056）、DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：C1195500BT）及胎牛血清（貨號(hào)：A3160801），購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素（貨號(hào)：SV30010）及PBS緩沖液（貨號(hào)：SH30256.01），購自美國HyClone 公司；Annexin V-FITC/PI apoptosis Kit-AP101 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：AP101），購自中國聯(lián)科生物公司。

1.2 主要儀器5430R 低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；FC500 流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；Infinite M1000 PRO 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan 公司）；IC1000 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Countstar 公司）；MultiRad225 放射儀器（美國Faxitron 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組人肺癌H1299 細(xì)胞由廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院提供，于飽和濕度的37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純放射組、苦參放射組?？瞻讓?duì)照組：不給藥，不照射；單純放射組：只照射，不給藥；苦參放射組：予一定濃度的復(fù)方苦參注射液處理細(xì)胞24 h 后照射。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)H1299 細(xì)胞增殖抑制率取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96 孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，按2 倍梯度稀釋法加入復(fù)方苦參注射液，使其終濃度分別為1、2、4、8、16 mg/mL，每個(gè)劑量設(shè)5 孔，培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h 后，棄上清，PBS 清洗，加MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄上清，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，測(cè)定450 nm 時(shí)的吸光度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按以下公式計(jì)算抑制率，擬合后求IC50值和IC20值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值］×100%。藥物作用后，細(xì)胞增殖抑制率＜20%時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用可相對(duì)忽略，因此選擇復(fù)方苦參注射液作用24 h 時(shí)的IC20進(jìn)行試驗(yàn)。取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純放射組、苦參放射組，X 射線照射劑量分別為2、4 Gy，計(jì)算各組的細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次后取均值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡接種1×105個(gè)細(xì)胞于60 mm 培養(yǎng)皿中，細(xì)胞分組同1.4，X 射線照射劑量為2 Gy，處理后PBS 沖洗待檢測(cè)細(xì)胞，離心后棄上清液，加500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，并加入5 μL Anneexin V-FITC 和10 μL PI 染色液，混勻后置于室溫避光反應(yīng)5 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次后取均值。

1.6 細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞分組同1.4，X 射線照射劑量為2 Gy，細(xì)胞照射后繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，倒掉培養(yǎng)基，PBS 沖洗，4%多聚甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)×100%，細(xì)胞存活率=處理組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞的藥物毒性不同濃度復(fù)方苦參注射液處理H1299 細(xì)胞24、48、72 h 后，各處理組細(xì)胞抑制率較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的細(xì)胞抑制率也逐漸升高，提示復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。復(fù)方苦參注射液處理H1299 細(xì)胞24、48、72 h 的IC50分別為14.46、8.51、3.52 mg/mL。復(fù)方苦參注射液處理H1299 細(xì)胞24、48、72 h 的IC20分別為2.97、0.94、0.42 mg/mL。見表1、圖1。

表1 復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of compound kushen injection on H1299 cells±s

表1 復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of compound kushen injection on H1299 cells±s

劑量（mg/mL）抑制率（%）0 1 2 481 6 24 h 0.00±0.00 9.98±5.35 14.63±5.16 23.18±2.04 32.40±4.30 53.01±4.81 48 h 0.00±0.00 23.36±2.15 27.08±4.28 43.87±5.75 52.45±0.76 68.94±3.51 72 h 0.00±0.00 38.28±3.62 43.10±3.36 54.99±3.04 68.35±2.35 85.63±2.79

2.2 復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射對(duì)H1299細(xì)胞增殖水平的影響當(dāng)增加復(fù)方苦參注射液干預(yù)后，可明顯增強(qiáng)放射線對(duì)H1299 細(xì)胞增殖的抑制作用，放射劑量2、4 Gy 時(shí)的抑制率分別為（33.03±2.49）%、（34.00±1.67）%，高于單純放射組的（12.73±10.06）%、（15.44±5.34）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射抑制H1299 細(xì)胞顯示出協(xié)同作用。見表2。

圖1 不同濃度復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Inhibition of compound kushen injection at different concentrations on H1299 cells

表2 復(fù)方苦參注射液聯(lián)合放射對(duì)H1299 細(xì)胞的抑制作用Tab.2 Inhibition of radiation combined with compound kushen injection on H1299 cells

2.3 復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞凋亡的影響單純放射組H1299 細(xì)胞的凋亡率（6.4 ± 0.4）%，高于空白對(duì)照組的（2.4 ± 0.3）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示放射線誘導(dǎo)H1299 細(xì)胞凋亡?？鄥⒎派浣MH1299 細(xì)胞的凋亡率（11.0 ± 0.3）%，較單純放射組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示復(fù)方苦參注射液能促進(jìn)放射線誘導(dǎo)H1299 細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.4 復(fù)方苦參注射液對(duì)放射后H1299 細(xì)胞存活率的影響單純放射組H1299 細(xì)胞存活率為（16.3 ±1.5）%，經(jīng)復(fù)方苦參注射液處理后，H1299 細(xì)胞存活率減少至（12.0 ± 1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖2 各組H1299 細(xì)胞凋亡情況比較Fig.2 Comparison of apoptosis of H1299 cells in various groups

圖3 各組細(xì)胞克隆形成情況Fig.3 Clone formation of cells in various groups

復(fù)方苦參注射液是以苦參、白土苓兩味中藥經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)加工制成，氧化生物堿是其主要活性成分。氧化苦參堿通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制端粒酶的活性、抑制腫瘤新生血管的形成等多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性［13-14］。本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物的放射增敏作用具有方便快捷的優(yōu)勢(shì)，MTT 法顯示當(dāng)增加復(fù)方苦參注射液干預(yù)后，可明顯增強(qiáng)放射線對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制作用，進(jìn)一步采用經(jīng)典的克隆形成法也證實(shí)了復(fù)方苦參注射液對(duì)H1299 細(xì)胞具有放射增敏作用。

細(xì)胞凋亡在放射反應(yīng)機(jī)制中占有重要地位，放射敏感性與腫瘤細(xì)胞自發(fā)性凋亡水平呈正相關(guān)趨勢(shì)［15-16］，腫瘤細(xì)胞凋亡率越高，放射敏感性越強(qiáng)［17-19］。對(duì)肺癌細(xì)胞株的研究也證實(shí)肺癌細(xì)胞放射敏感性與凋亡率呈正相關(guān)［20］。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)苦參放射組肺癌細(xì)胞的凋亡率較單純放射組增加，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苦參放射組肺癌細(xì)胞存活率降低即放射敏感度增高，提示復(fù)方苦參注射液通過促進(jìn)放射線誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡，從而增加肺癌細(xì)胞的放射敏感度。

筆者推測(cè)復(fù)方苦參注射液可通過抑制H1299肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，從而提高肺癌細(xì)胞的放射敏感度。但本研究尚停留在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，且未對(duì)復(fù)方苦參注射液放射增敏作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入分析，未來應(yīng)該通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步探討復(fù)方苦參注射液對(duì)肺癌細(xì)胞的放射增敏作用。