向文揚(yáng) 楊永慶 任秋燕 晉彤彤 王麗群 王大剛 智海劍

大豆抗SC3候選基因的克隆及分析

向文揚(yáng) 楊永慶 任秋燕 晉彤彤 王麗群 王大剛 智海劍*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所/ 農(nóng)業(yè)部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家大豆改良中心/ 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210095

大豆花葉病毒(, SMV)病是大豆主要的病害之一, 給我國(guó)大豆生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的損失。大豆抗病育種是目前防治大豆花葉病毒病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施, 發(fā)掘抗病基因是抗病育種的基礎(chǔ)。本文在前期對(duì)大豆抗SMV株系SC3基因精細(xì)定位的基礎(chǔ)上, 克隆了2個(gè)具有TIR-NBS-LRR典型抗病結(jié)構(gòu)域的基因(和)。生物信息學(xué)分析表明,和基因均在抗感品種中存在氨基酸位點(diǎn)的突變, 而且突變位點(diǎn)都位于保守結(jié)構(gòu)域內(nèi), 這2個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)為煙草花葉病毒(TMV)抗性N蛋白; 物種間同源比對(duì)結(jié)果顯示,和基因與野生大豆親緣較近。qRT-PCR結(jié)果表明,和能夠響應(yīng)SMV的侵染增加表達(dá)量, 且在抗病品種中的表達(dá)量高于感病品種。2個(gè)基因存在IN1、IN2和IN3不同的剪接體, 所有的剪接體都能夠響應(yīng)病毒的誘導(dǎo)增加表達(dá)量, 且在抗病品種中的表達(dá)量高于感病品種, IN1和IN2的表達(dá)量隨時(shí)間的變化較為明顯, IN3的表達(dá)量則相對(duì)穩(wěn)定, 說(shuō)明這些剪接體可能參與大豆對(duì)SMV的抗病過(guò)程。本研究為后續(xù)基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

大豆花葉病毒; 抗病基因; 誘導(dǎo)表達(dá); 可變剪接

大豆花葉病毒病是由大豆花葉病毒(SMV)引發(fā)的一種大豆病害, 在我國(guó)主要大豆產(chǎn)區(qū)都有分布, 給我國(guó)大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來(lái)嚴(yán)重影響[1]。目前大豆花葉病毒的防治主要從3個(gè)方面入手, 第一是控制SMV初侵染源, 帶毒大豆種子是SMV初侵染來(lái)源[2], 優(yōu)選大豆種子, 特別是不用前一年發(fā)病植株上收獲的種子可以一定程度上防治SMV的危害; 第二是控制SMV的田間傳播, 蚜蟲(chóng)是SMV田間傳播的主要媒介[1,3], 及時(shí)發(fā)現(xiàn)并殺滅蚜蟲(chóng)能減少SMV在田間的傳播; 第三是選育優(yōu)良的大豆抗SMV品種, 這是最經(jīng)濟(jì)有效的防治方法。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多關(guān)于抗SMV基因研究的報(bào)道。美國(guó)學(xué)者從不同的抗SMV種質(zhì)中分別發(fā)現(xiàn)了4個(gè)抗病位點(diǎn)、、和[4-7], 并將其定位在D1b (第2染色體)、F (第13染色體)和B2 (第14染色體) 3個(gè)連鎖群上, 并在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)這些抗病位點(diǎn)的多個(gè)等位位點(diǎn); 我國(guó)針對(duì)不同的SMV株系從抗性種質(zhì)中定位出了多個(gè)抗病基因, 分別命名為R抗病位點(diǎn)等, 這些基因分布在D1b、F、C2 (第6染色體)和B2四個(gè)連鎖群上。從物理和遺傳圖譜位置上來(lái)看, 美國(guó)和我國(guó)定位出來(lái)的抗病基因可能存在重疊或者處于相近區(qū)域。

目前關(guān)于基因(resistance gene)的研究在國(guó)內(nèi)外有很多的報(bào)道, 在不同的物種中已經(jīng)有幾十個(gè)抗性基因被成功克隆[8-11]。這些基因介導(dǎo)對(duì)不同病原的抗性, 盡管其來(lái)源不同, 但是絕大多數(shù)的基因具有高度保守的蛋白結(jié)構(gòu)域, 其中典型的保守結(jié)構(gòu)域包括核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site, NBS)、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(leucine zipper, LZ)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(serine-threonine kinase, STK)、toll蛋白/白細(xì)胞介素-1受體類(lèi)似結(jié)構(gòu)域(toll- interleukin-1 receptor, TIR)、亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)(leucine-rich repeat, LRR)、跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM)等, 其中TIR-NBS-LRR類(lèi)結(jié)構(gòu)基因是目前鑒定的基因中最多的一類(lèi)。

大豆抗SMV基因的分離和鑒定已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展。Davis[12]在大豆品種L29中發(fā)現(xiàn)了抗SMV候選基因, 并通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草中共表達(dá)該基因與大豆花葉病毒蛋白CI, 結(jié)果表明該基因與SMV蛋白CI相互作用導(dǎo)致煙草植株出現(xiàn)了壞死癥狀, 說(shuō)明可能參與對(duì)SMV的抗性。Tran等[13]在不含的大豆品種瞬時(shí)表達(dá)使其獲得了對(duì)SMV株系G5H的系統(tǒng)抗性; 同時(shí)使用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(virus-induced gene silencing, VIGS)沉默含有大豆品種中的使其喪失了對(duì)G5H的抗性。G533和實(shí)際上為同一個(gè)基因, 該結(jié)果初步確認(rèn)基因與大豆對(duì)SMV的抗性有關(guān)。

大部分的植物基因含有內(nèi)含子, 這些基因轉(zhuǎn)錄形成的前體mRNA需要經(jīng)過(guò)剪接后才能形成成熟的mRNA, 前體mRNA的剪接方式可以分為組成性剪接(constitutive splicing)和選擇性剪接(alternative splicing)[14-15], 其中選擇性剪接是高等生物普遍存在的一種基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制, 能夠增加基因產(chǎn)物的多樣性, 提高植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力, 已有研究表明, 可變剪接在植物抗病反應(yīng)、抗脅迫逆境反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用[16-18]。按照剪接方式的不同, 可變剪接主要分為內(nèi)含子保留(intron retention)、外顯子丟失(exon skip)、可變供體(alternative donor site)、可變受體(alternative donor site)及外顯子互斥(mutually exclusive exons)等[19], 內(nèi)含子保留是最為常見(jiàn)的可變剪接形式[20]。研究植物的可變剪接可以提高對(duì)植物基因功能多樣性的理解, 目前關(guān)于大豆抗SMV基因定位的研究已有很多,但鑒定分離成功的抗病基因還很少, 候選基因可變剪接體的分析可以為大豆抗SMV基因的分離鑒定提供全新的視角。

楊永慶等[21]在PI96983品種中將大豆抗SC3基因R定位在了大豆第13染色體為345 kb的物理區(qū)間內(nèi), 本文在該研究的基礎(chǔ)上對(duì)這個(gè)區(qū)間內(nèi)的可能的抗病基因進(jìn)行篩選, 搜索到了2個(gè)高度同源(99%同源性)的具有TIR-NBS-LRR典型抗病結(jié)構(gòu)域的基因和, 克隆這2個(gè)基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 同時(shí)檢測(cè)了這2個(gè)基因及其剪接體在病毒誘導(dǎo)條件下的表達(dá), 初步探討了和的結(jié)構(gòu)及其可能的功能, 為后續(xù)基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆品種南農(nóng)1138-2、齊黃1號(hào)、Williams 82及PI96983均由國(guó)家大豆改良中心保存提供, SMV株系SC3由本課題組保存提供。其中齊黃1號(hào)和PI96983為抗SMV株系SC3的品種, Wiliams 82和南農(nóng)1138-2是 SMV株系SC3的感病品種。

1.2 材料種植及處理

本實(shí)驗(yàn)所使用的大豆材料均種植于溫度為25℃、濕度為65℃、光照10 h/黑夜8 h的恒溫培養(yǎng)室中; 在大豆第1對(duì)真葉展開(kāi)時(shí)利用摩擦接種法[22]接種, 實(shí)驗(yàn)組處理為接種SMV株系SC3, 對(duì)照組為接種磷酸緩沖液(0.01 mol L-1磷酸鈉, 0.01 mol L-1磷酸鉀或0.05 mol L-1檸檬酸鈉, pH 7)。

1.3 植物總RNA的提取及第1鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄

提取植物總RNA的嚴(yán)格按照RNAprep pure Plant Kit (購(gòu)于TIANGEN)說(shuō)明書(shū)。利用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè), 選取質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行第1鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄, 按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (購(gòu)于TAKARA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 基因克隆

由于及具有高度同源性, 故采用特異性較高的巢式PCR (Nested-PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。以NCBI上公布的Williams 82基因組Wm82.a2.v1數(shù)據(jù)庫(kù)為參考, 利用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。首先使用引物對(duì)GmR47-1和GmR51-1進(jìn)行第1步PCR, 反應(yīng)體系為50 μL, 包含酶25 μL 2×PrimerStar Master Mix (Takara)、上下游引物(濃度為10 μmol L-1)各1 μL、模板cDNA 1 μL、滅菌ddH2O 22 μL。PCR程序?yàn)?5℃ 3 min; 98℃ 10 s, 58℃ 15 s, 72℃ 45 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。然后使用引物對(duì)GmR47-2和GmR51-2進(jìn)行第2步PCR, 反應(yīng)體系為50 μL, 包含酶25 μL 2×PrimerStar Master Mix (Takara)、上下游引物(濃度為10 μmol L-1)各1 μL、模板為第1步PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL、滅菌ddH2O 22 μL。反應(yīng)程序同上。利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)第2步PCR反應(yīng)產(chǎn)物, 回收條帶大小正確的產(chǎn)物。并將回收產(chǎn)物使用T4連接酶連接至T-easy載體pMD20-T, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α中過(guò)夜培養(yǎng), 挑取單克隆, 將檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆送至通用生物公司測(cè)序。

表1 基因克隆引物及熒光定量引物

引物名稱(chēng)中含有qPCR的為實(shí)時(shí)熒光定量引物。

The primer’s name contained ‘qPCR’ means its Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) primer.

1.5 序列生物信息學(xué)分析

比對(duì)堿基及氨基酸序列使用BioXM軟件; 通過(guò)NCBI BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)搜索下載煙草、擬南芥、野生大豆等10個(gè)不同植物中候選基因的氨基酸同源序列, 使用MEGA 7軟件及鄰近法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù); 使用Interpro (http://www.ebi.ac.uk/ interpro)軟件分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域及預(yù)測(cè)功能; 使用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu), 使用Phyre2 (http://www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 熒光定量

按照熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (購(gòu)于VEZYME)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量反應(yīng), 內(nèi)參基因選擇(登錄號(hào)為AY907703), 每個(gè)樣品和內(nèi)參均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn), qPCR條件為95℃ 1 min; 98℃ 10 s, 60℃ 15 s, 72℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán)。和相似度高達(dá)99%, 無(wú)法利用1對(duì)引物將其區(qū)分, 故將這2個(gè)基因的表達(dá)量統(tǒng)一討論,及熒光定量引物見(jiàn)表1。分析熒光定量結(jié)果采用2-DDCt法[23], 以接種磷酸緩沖液的對(duì)照組候選基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)品, 計(jì)算接種SC3實(shí)驗(yàn)組候選基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 可變剪接體的檢測(cè)及誘導(dǎo)表達(dá)分析

和均存在3個(gè)含子, 分別在這3個(gè)內(nèi)含子處設(shè)計(jì)了2對(duì)引物, 1對(duì)是跨內(nèi)含子, 設(shè)計(jì)在2個(gè)相鄰?fù)怙@子上的常規(guī)引物, 另外1對(duì)是引物在內(nèi)含子內(nèi)的特異性引物, 內(nèi)含子檢測(cè)引物見(jiàn)表2。以PI96983、南農(nóng)1138-2和齊黃1號(hào)3個(gè)大豆品種的cDNA為模板進(jìn)行PCR, 檢測(cè)可變剪接是否在這2個(gè)基因中存在, 此處使用的cDNA模板經(jīng)過(guò)去基因組DNA處理, 排除cDNA模板中的基因組DNA的污染。按照HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)熒光反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于VEZYME)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行去基因組DNA污染的反轉(zhuǎn)錄。可變剪接體的誘導(dǎo)表達(dá)分析以每個(gè)內(nèi)含子處的總剪接體數(shù)為單位進(jìn)行, 每個(gè)剪接體處的熒光定量引物見(jiàn)表2。

表2 可變剪接檢測(cè)引物及熒光定量引物

引物名中含有Uni的為不含特異性的常規(guī)引物; 含Spe的為內(nèi)含子上的特異性引物; 含qPCR的為熒光定量引物。

The primer’s name contained ‘Uni’ means the conventional primers without specificity; those contained ‘Spe’ means intron specific primer; those contained ‘qPCR’ means qRT-PCR primer.

1.8 亞細(xì)胞定位

使用在引物5'端含有GateWay元件的引物擴(kuò)增和完整的開(kāi)放閱讀框, 其中不包含終止子。利用GateWay系統(tǒng)構(gòu)建載體, 經(jīng)過(guò)BP反應(yīng)及LR反應(yīng), 將目的基因構(gòu)入pGWB5載體獲得目的基因與融合的載體pGWB5--和pGWB5--。使用農(nóng)桿菌注射的方法侵染煙草[24], 侵染煙草48 h后, 利用Leica TCS SP2激光共聚焦熒光顯微鏡觀察注射煙草細(xì)胞中熒光信號(hào)的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因的克隆

通過(guò)已公布的Williams 82基因組數(shù)據(jù), 分別獲得和的參考序列, 比對(duì)參考序列可知2個(gè)基因具有高度同源性。克隆大豆品種PI96983中的抗病候選基因和, 設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物分別對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增, 以大豆品種PI96983的cDNA為模板擴(kuò)增獲得大小為3500 bp左右的目標(biāo)片段。測(cè)序結(jié)果顯示, 大豆品種PI96983中和基因均含有一個(gè)大小為3288 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF), 均編碼1095個(gè)氨基酸殘基。編碼合成的蛋白質(zhì)分子量為125.34 kD, 等電點(diǎn)為6.69;編碼合成的蛋白質(zhì)分子量為125.4 kD, 等電點(diǎn)為6.64。

2.2 候選基因生物信息學(xué)分析

和編碼的蛋白產(chǎn)物含有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域, 從N端到C端分別為T(mén)IR、NBS及LRR結(jié)構(gòu)域, 是典型的TIR-NBS-LRR家族基因(圖1), 預(yù)測(cè)的蛋白功能為煙草花葉病毒(TMV)抗性N蛋白。、在抗病品種PI96983及感病品種南農(nóng)1138-2之間的氨基酸序列差異(圖2)顯示,在抗感品種之間存在8個(gè)SNP的差異, 導(dǎo)致5個(gè)氨基酸突變, 突變位點(diǎn)在TIR、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域中均有分布;在抗感品種之間存在8個(gè)SNP差異, 導(dǎo)致3個(gè)氨基酸突變, 突變位點(diǎn)分布在NBS和LRR結(jié)構(gòu)域中。和在不同物種間的同源比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示,和基因在野生大豆中的親緣性最近, 其次是苜蓿。

圖1 GmR47和GmR51編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

A:編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。B:編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

A: conservative domain prediction of-encoded proteins. B: conservative domain prediction of-encoded proteins.

圖2 GmR47和GmR51編碼的核苷酸序列在抗病品種(PI96983)及感病品種(南農(nóng)1138-2)之間的比對(duì)結(jié)果

A: GmR47編碼氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。B: GmR51編碼氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果。

A: alignment result of amino acid sequence encoded by GmR47; B: alignment result of amino acid sequence encoded by GmR51.

2.3 GmR47和GmR51基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4-A表明, 在二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)占45.84%, 延伸鏈占15.07%, β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占5.57%, 不規(guī)則卷曲占33.52%;編碼的蛋白產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4-B)中α螺旋結(jié)構(gòu)占45.02%, 延伸鏈占16.07%, β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占5.57%, 不規(guī)則卷曲占33.33%?？垢胁∑贩N中和編碼蛋白產(chǎn)物預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5, 顯示和基因編碼蛋白產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)在抗感品種中存在差異。

2.4 候選基因在抗感品種之間的表達(dá)量差異

利用SC3接種抗感品種誘導(dǎo)候選基因的表達(dá), 檢測(cè)抗感品種之間表達(dá)量的差異。實(shí)驗(yàn)組采用SMV株系SC3接種, 對(duì)照組用磷酸緩沖液處理。分別在處理后的0、1、2、4、8、12、24、48、72 h以及7 d采集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的處理葉片。熒光定量的結(jié)果顯示(圖6), 候選基因在抗病品種中的表達(dá)量變化趨勢(shì)是先升后降再升, 分別在2 h、7 d達(dá)到峰值, 最高值約為未接種時(shí)表達(dá)量的2倍; 在24 h達(dá)到最低值, 此時(shí)表達(dá)量與未接種時(shí)持平。候選基因在感病品種表達(dá)量的變化不大, 在12 h時(shí)取得最低值, 約為未接種時(shí)表達(dá)量的0.5倍, 在24 h達(dá)到峰值, 約為未接種時(shí)表達(dá)量的1.6倍; 由此看出, 感病品種中候選基因的表達(dá)量相對(duì)平穩(wěn), 而在抗病品種中表達(dá)量則有較大的起伏變化, 在抗病品種中的表達(dá)量要高于感病品種中。說(shuō)明候選基因和能夠積極的響應(yīng)SMV的誘導(dǎo)提高表達(dá)量。

圖3 GmR47和GmR51基因在不同物種間的同源進(jìn)化樹(shù)

圖4 GmR47 (A)和GmR51 (B)基因編碼的氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 可變剪接體的分析

和基因均存在3個(gè)內(nèi)含子, 為檢測(cè)其內(nèi)含子處的可變剪接現(xiàn)象, 在每個(gè)內(nèi)含子處設(shè)計(jì)了1對(duì)常規(guī)引物和1對(duì)特異性引物, 以齊黃1號(hào)、PI96983、南農(nóng)1138-2和Williams 82的去基因組污染的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果顯示(圖7), 在這3個(gè)內(nèi)含子處, 跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)在相鄰?fù)怙@子上的常規(guī)引物均擴(kuò)增出2條或2條以上的條帶, 且設(shè)計(jì)在內(nèi)含子上的特異性引物同樣擴(kuò)增出了條帶。說(shuō)明和基因在這3個(gè)內(nèi)含子處均存在可變剪接的現(xiàn)象, 并且可變剪接現(xiàn)象在4個(gè)大豆品種中均存在。將常規(guī)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測(cè)序顯示(圖8), 3個(gè)內(nèi)含子處均存在內(nèi)含子保留可變剪接體, 由于和基因的高度同源性, 未能檢測(cè)出每個(gè)基因的不同可變剪接體。

圖5 抗感品種中GmR47和GmR51基因編碼合成的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

A: PI96983; B: PI96983; C: 南農(nóng)1138-2; D: 南農(nóng)1138-2。

A: PI96983; B: PI96983; C: Nannong 1138-2; D: Nannong 1138-2.

圖6 PI96983和南農(nóng)1138-2接種SMV后GmR47及GmR51基因的總表達(dá)量隨時(shí)間的變化

圖7 可變剪接體的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

上排條帶為常規(guī)引物擴(kuò)增的結(jié)果, 下排條帶為內(nèi)含子特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果, 相鄰的4個(gè)條帶為4個(gè)品種間的擴(kuò)增結(jié)果。A: 齊黃1號(hào); B: PI96983; C: 南農(nóng)1138-2; D: Williams 82; M: marker。

The upper bands are the result of amplification of theconventional primer, the lower bands are the amplification result of the intron-specific primer, adjacent four bands are amplification from four varieties. A: Qihuang 1; B: PI96983; C: Nannong 1138-2; D: Williams 82; M: marker.

由于和基因具有高度同源性, 且基因組較大, 無(wú)法單獨(dú)對(duì)某個(gè)剪接體進(jìn)行分析, 為研究不同剪接體對(duì)SMV的響應(yīng)情況, 本文以每個(gè)內(nèi)含子處存在的總剪接體為單位進(jìn)行表達(dá)量分析, 即在每個(gè)內(nèi)含子內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行熒光定量, 將3個(gè)內(nèi)含子處存在的總剪接體分別命名為IN1、IN2和IN3?？勺兗艚诱T導(dǎo)表達(dá)所采用的實(shí)驗(yàn)材料為PI9683和南農(nóng)1138-2, 實(shí)驗(yàn)組處理為接種SC3病毒, 對(duì)照組為接種磷酸緩沖液, 抗病品種及感病品種均設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在處理后的0、1、2、4、8、12、24、48、72 h以及7 d內(nèi)采集處理葉片, 并進(jìn)行熒光定量分析。熒光定量結(jié)果(圖9)顯示, IN1的表達(dá)量(圖9-A)在抗病品種中的趨勢(shì)是先升再降再升, 在感病品種中的趨勢(shì)是先降再升再降, 其中2、4、8、72 h在抗感品種之間存在顯著差異; IN2的表達(dá)量(圖9-B)在抗感病品種中的變化趨勢(shì)是先升再降, 抗病品種中候選基因在24 h表達(dá)量達(dá)到峰值, 在感病品種中在12 h表達(dá)量達(dá)到峰值; IN3的表達(dá)量(圖9-C)在抗病品種中的變化趨勢(shì)是先升后維持較高表達(dá)水平, 在感病品種中表達(dá)量變化不大。以上結(jié)果表明, IN1、IN2和IN3的的表達(dá)量都能響應(yīng)病毒的誘導(dǎo), 并且抗病品種中的表達(dá)量要高于感病品種。不同內(nèi)含子間可變剪接體的表達(dá)量存在差異, IN1表達(dá)量隨病毒侵染時(shí)間的變化較為明顯, 而IN2和IN3的表達(dá)量則相對(duì)平穩(wěn)。總的來(lái)說(shuō),和在3個(gè)內(nèi)含子處均含有可變剪接現(xiàn)象, 而且能夠響應(yīng)病毒的誘導(dǎo)表達(dá), 說(shuō)明這些可變剪接體可能參與大豆對(duì)SMV的抗性。

(圖8)

A:基因可變剪接體示意圖; B: IN1序列; C: IN2序列; D: IN3序列。

A: schematic diagram of alternative splicing ofgene; B: IN1 sequence; C: IN2 sequence; D: IN3 sequence.

圖9 PI96983和南農(nóng)1138-2接種SMV后GmR47及GmR51基因在不同內(nèi)含子處的剪切體的總表達(dá)量隨時(shí)間的變化

A: 內(nèi)含子1處的剪接體的總表達(dá)量; B: 內(nèi)含子2處的剪接體的總表達(dá)量; C: 內(nèi)含子3處的剪接體的總表達(dá)量。

A: total expression of alternative splicing in Intron 1; B: total expression of alternative splicing in Intron 2; C: total expression of alternative splicing in Intron 3.

2.6 候選基因的亞細(xì)胞定位

利用Cell-PLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)和編碼的蛋白質(zhì)作用的位置預(yù)測(cè)顯示,編碼的蛋白產(chǎn)物分布在細(xì)胞膜上,編碼的蛋白產(chǎn)物分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。構(gòu)建植物表達(dá)載體pGWB5--及pGWB5--并利用PCR法, 酶切法和測(cè)序法對(duì)其驗(yàn)證, 選擇構(gòu)建正確的載體進(jìn)行煙草侵染。在侵染煙草后的48 h觀察煙草細(xì)胞中的熒光分布, 結(jié)果顯示(圖10), pGWB5--和pGWB5--融合蛋白在在細(xì)胞膜和核膜上有熒光信號(hào), 證實(shí)了和編碼的蛋白產(chǎn)物均分布在細(xì)胞膜和核膜上, 以上結(jié)果說(shuō)明,和編碼的蛋白產(chǎn)物為膜蛋白。

3 討論

本文發(fā)現(xiàn)候選基因能響應(yīng)SMV的侵染而增加表達(dá)量, 說(shuō)明候選基因能夠參與對(duì)SMV的抗性反應(yīng), 但其表達(dá)量與CP含量的變化趨勢(shì)并不一致, 推測(cè)其原因可能是植物抗病過(guò)程由多個(gè)基因共同作用, 單個(gè)基因的高表達(dá)并不一定能使抗性增強(qiáng)而直接降低病毒量。

美國(guó)以不同抗性的種質(zhì)定位出、等抗病基因, 目前已經(jīng)從PI96983中初步鑒定了具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗SMV基因[25], 該基因有可能為, 從遺傳距離和物理距離上來(lái)看,和我國(guó)定位的距離很近, 可能互為等位基因或處于相近區(qū)域; 韓國(guó)學(xué)者鑒定L29中的為抗病基因, 證明其有可能為[8], 該基因與我國(guó)大白麻含有的基因位點(diǎn)相同, 初步說(shuō)明L29與大白麻可能含有相同抗病基因; 在我國(guó), 目前確定為抗SMV基因的候選基因還較少,黃賽花等[26]利用VIGS沉默齊黃1號(hào)中R候選基因使抗SMV植株的抗病性發(fā)生改變, 初步證明為抗病基因參與齊黃1號(hào)對(duì)SMV的抗性。本文根據(jù)生物信息學(xué)和表達(dá)量分析的結(jié)果, 初步推測(cè)和基因?yàn)榭筍MV基因, 至于候選基因是否為SMV抗性基因, 還需要VIGS、轉(zhuǎn)基因以及CRIPSR-CAS9基因靶向編輯等實(shí)驗(yàn)后續(xù)證明。

可變剪接可以使一個(gè)基因生成多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 極大地提高基因產(chǎn)物的多樣性, 是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制, 在植物的抗病、抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于大豆抗病基因的研究主要是以基因轉(zhuǎn)錄生成的前體RNA組成型切割體為基礎(chǔ), 而較少基于可變剪接體, 但在其他作物上已有關(guān)于可變剪接體參與植物抗性反應(yīng)的報(bào)道, 如水稻抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)錄后存在2種可變剪接體, 其中介導(dǎo)對(duì)稻瘟病的抗性, 而另一種剪接形式則沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病的抗性[27], 結(jié)果說(shuō)明基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的不同剪接體可能具有截然不同的功能。本文在大豆抗病候選基因及中檢測(cè)到可變剪接現(xiàn)象的存在, 發(fā)現(xiàn)這些可變剪接體能夠響應(yīng)SMV的侵染增加表達(dá)量, 并且在抗病品種和感病品種之間的表達(dá)量存在較為明顯的差異, 說(shuō)明這2個(gè)基因的可變剪接體可能參與抗病品種對(duì)SMV的抗性。和基因剪接體的發(fā)現(xiàn), 為其基因功能的鑒定提供了新的視角。但由于和基因具有較高同源性, 且基因各個(gè)內(nèi)含子處均存在可變剪接, 候選基因每個(gè)可變剪接體的存在形式還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

從大豆品種PI96983中擴(kuò)增了2個(gè)TIR-NBS- LRR結(jié)構(gòu)基因, 分別命名為和。它們高度同源, 均含有一個(gè)3288 bp的開(kāi)放閱讀框, 編碼1095個(gè)氨基酸。在抗病品種(PI96983)和感病品種(南農(nóng)1138-2)中存在8個(gè)SNP差異, 最終導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生突變;在抗病品種和感病品種中也存在8個(gè)SNP差異, 最終導(dǎo)致3個(gè)氨基酸突變。和親緣最近的物種是野生大豆。和基因編碼的蛋白產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞膜和核膜上。和基因在抗感病品種中均存在可變剪接現(xiàn)象, 2個(gè)基因及其可變剪接體均能夠響應(yīng)病毒的誘導(dǎo)提高表達(dá)量, 且在抗病品種中的表達(dá)量高于感病品種, 其中可變剪接體IN1和IN2的表達(dá)量變化較為明顯, IN3的表達(dá)量則相對(duì)平穩(wěn)。初步推測(cè)候選基因和為抗SMV基因, 其可變剪接體可能參與對(duì)SMV的抗性。

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Cloning and analysis of candidate gene resistant to SC3 in soybean

XIANG Wen-Yang, YANG Yong-Qing, REN Qiu-Yan, JIN Tong-Tong, WANG Li-Qun, WANG Da-Gang, and ZHI Hai-Jian*

Institute of Soybean, Nanjing Agricultural University / Key Laboratory of Soybean Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture / National Center for Soybean Improvement / State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Innovation, Nanjing 210095, Jiangsu, China

(SMV) is one of the prevalent pathogens of soybean, causing great reduction of soybean yield worldwide. Soybean disease resistance-breeding is currently the most cost-effective measure to control SMV, and identification of resistance genes is the basis of disease resistance breeding. According to the previous mapping result of resistance gene to SMV strain SC3, two genes (,) with TIR-NBS-LRR domain were cloned. Bioinformatics analysis showed that bothandgenes have SNP mutations in the susceptible varieties and resistant varieties, and the mutation sites are located in the conserved domain. These two proteins encoded byandgenes are predicted to be(TMV) resistant N proteins. The results of homologous alignment between species indicated thatandgenes were close to those of wild soybean. The expression ofandwas analyzed after inoculation with soybean mosaic virus in soybean, demonstrating thatandcould increase the expression level in response to SMV infection, with the higher level in resistant varieties than in susceptible varieties. Analysis of the alternative splicing ofandrevealed that the two genes have different splice variants IN1, IN2, and IN3. The response analysis of splices to SMV showed that all splices were able to increase the expression in response to virus induction, with the higher level in resistant varieties than in susceptible varieties. It indicated that these alternative splicing may be involved in the disease resistance process of soybean to SMV. The result of this study lay a foundation for the study of subsequent gene function.

(SMV); resistance gene; inducing expression; alternative splicing

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2016ZX08004-004), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571690, 31571687), 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(KYT201801), 長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(PCSIRT_17R55), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-04), 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(JCIC-MCP)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0101501)資助。

This study was supported by the Fund of Transgenic Breeding for Soybean Resistance to Soybean mosaic virus (2016ZX08004-004 ), the National Natural Science Foundation of China (31571690, 31571687), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (KYT201801), the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (PCSIRT_17R55), the National Soybean Industrial Technology System of China (CARS-004), Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production (JCIC-MCP), and the National Key R&D Program of China (2017YFD0101501).

智海劍, E-mail: zhj@njau.edu.cn

E-mail: a15295572307@163.com

2019-04-02;

2019-06-22;

2019-07-15.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190712.1641.010.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94054