王崇　王連軍　雷劍　蘇文瑾　柴沙沙　楊新筍　張文英

摘要：NBS-LRR是植物中已分離抗病基因最大的一類，Target of AvrB Operation（TAO1）屬于NBS-LRR類基因。以甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]抗病相關(guān)的TAO1基因作為靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)出1條固定引物，與11條隨機(jī)引物組合成11對(duì)引物。利用這11對(duì)引物對(duì)甘薯品種鄂薯11、鄂紫薯13進(jìn)行TRAP-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)11個(gè)引物組合擴(kuò)增出清晰條帶，且表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。該研究獲得與TAO1-like基因相關(guān)聯(lián)的TRAP標(biāo)記，該標(biāo)記可進(jìn)行甘薯群體的遺傳多樣性分析，為甘薯的抗病育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.];抗病;NBS-LRR類基因;TAO1;TRAP標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S531;Q78 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）18-0152-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.037 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

TRAP analysis of disease resistance related gene TAO1-like in sweet potato

WANG Chong1，2，WANG Lian-jun2，LEI Jian2，SU Wen-jin2，CHAI Sha-sha2，YANG Xin-sun2，ZHANG Wen-ying1

（1.College of Agriculture， Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China;2.Hubei Academy of Agricultural Sciences，Institute of Food Corps/Hubei Sweet Potato Engineering and Technology Research Centre/Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China）

Abstract： NBS-LRR is the largest class of isolated disease resistance genes in plants， Target of AvrB Operation（TAO1）belongs to NBS-LRR class genes. Using sweet potato disease resistance genes NBS-LRR as target gene to design one fixed primer，and for paring 11 pairs primers with 11 arbitrary primers. The 11 pairs of primers were used for TRAP-PCR amplification of sweet potato cultivars Eshu 11 and Ezishu 13. It was found that 11 primer combinations amplified clear bands and showed good polymorphism. The TRAP marker that associated with the TAO1-like gene were obtained， which could be used to analyze the genetic diversity of sweet potato population and provide a theoretical basis for disease resistance breeding of sweet potato.

Key words： sweet potato [Ipomoea batatas（L.） Lam.]; disease resistance; NBS-LRR gene; TAO1; TRAP marker

甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物。中國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)，常年種植面積550萬(wàn)hm2，鮮薯產(chǎn)量1.2億t，分別占世界甘薯種植總面積和總產(chǎn)量的60%和85%[1]。甘薯在遺傳上高度雜合，種內(nèi)、種間雜交不親和以及遺傳資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，病蟲(chóng)害、病毒病危害嚴(yán)重，制約了甘薯品種的遺傳改良[2]。

很多甘薯近緣野生種具有抗病蟲(chóng)、抗逆等優(yōu)良基因[3]?？共』蛲葱蛄校≧esistance gene analog，RGA）是一種存在植物基因組中具有特定保守結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)段，RGA還具有容易獲得、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定和使用費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此以RGA區(qū)段的保守性為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)PCR特異兼并引物，擴(kuò)增R基因同源序列，進(jìn)行抗病基因的分離和克隆，已經(jīng)成為當(dāng)前比較流行的克隆植物抗病基因的策略之一[4]。NBS-LRR類基因根據(jù)表達(dá)出的蛋白質(zhì)N端的不同，可以分為4類：TIR-NBS-LRR、LZ-NBS-LRR、CC-NBS-LRR和NBS-LRR等[5]。TAO1屬于TIR-NBS-LRR類，主要功能是參與植物的防御反應(yīng)[6]。目前在甘薯[7]、水稻[8]、小麥[9]、蘋果[10]、棉花[11]等植物中已成功分離克隆出NBS-LRR類抗病基因同源序列。

TRAP技術(shù)[12]是由SRAP技術(shù)[13]發(fā)展而來(lái)，是一種基于已知的cDNA或EST序列信息的分子標(biāo)記，固定引物長(zhǎng)度為16～20 bp，隨機(jī)引物長(zhǎng)度18 bp，具有簡(jiǎn)單、高效、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已在水稻[14]、小麥[15]、煙草[16]、棉花[17]等多種作物中得到了廣泛應(yīng)用。本研究基于植物NBS-LRR類抗病基因的保守區(qū)域，采用TRAP標(biāo)記技術(shù)，旨在評(píng)價(jià)分析TRAP標(biāo)記技術(shù)在甘薯研究中的利用價(jià)值，發(fā)掘出能有效與NBS-LRR類基因緊密連鎖的TRAP標(biāo)記，為篩選甘薯抗病品種提供一定的理論依據(jù)，為甘薯抗病性遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為高抗蔓割病、抗根腐病、抗莖線蟲(chóng)病，感黑斑病的甘薯品種鄂薯11;感蔓割病、高感根腐病、中抗莖線蟲(chóng)病、高感黑斑病的甘薯品種鄂紫薯13，種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)基地。

1.2 ?引物設(shè)計(jì)

利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)NCBI登錄號(hào)搜索到NBS-LRR類抗病基因序列，以TAO1-like基因?yàn)榘袠?biāo)基因設(shè)計(jì)1條固定引物，固定引物大小為18 bp，退火溫度在50 ℃最為適宜，參考引用Li等[18]已發(fā)表的11條隨機(jī)引物（表1），均委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司（武漢）合成。

1.3 ?DNA的提取

采取鄂薯11、鄂紫薯13的新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法[19]提取甘薯總DNA。將DNA稀釋到PCR反應(yīng)所需的濃度（50～60 ng/μL），在-20 ℃保存，備用。

1.4 ?PCR擴(kuò)增

使用S1000TM Thermal Cycler（BioRad）PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×Buffer（Mg2+） 5.0 μL，dNTPs（10 mmol/L each）4.0 μL，固定引物1.0 μL，隨機(jī)引物1.0 μL，基因組 DNA（50～60 ng/μL）1.0 μL，Easy-Taq DNA Polymerase 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL;TRAP反應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán);然后94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，冷卻至10 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上電泳，105 V電泳4 h后銀染，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?TRAP標(biāo)記多態(tài)性分析

利用11對(duì)引物對(duì)2個(gè)試驗(yàn)材料進(jìn)行TRAP標(biāo)記分析，11對(duì)引物的擴(kuò)增條帶大小在100～800 bp，每對(duì)引物組合可產(chǎn)生8～17條清晰、穩(wěn)定條帶，且不同TRAP引物擴(kuò)增帶型、擴(kuò)增數(shù)量和分布均勻程度具有較大差異（圖1）。每個(gè)組合都擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，每個(gè)組合擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為5～12條，表明設(shè)計(jì)的引物具有良好的多態(tài)性，可用于進(jìn)一步的分析研究。

2.2 ?TAO1-like的TRAP分析

對(duì)11對(duì)引物組合的多態(tài)性條帶分析，多態(tài)性條帶主要集中在200～500 bp。鄂薯11與鄂紫薯13的抗病性存在差異，發(fā)現(xiàn)某些擴(kuò)增條帶在鄂薯11中出現(xiàn)，而在鄂紫薯13中沒(méi)有出現(xiàn)。如圖1箭頭所指，引物對(duì)s+em6在鄂薯11中擴(kuò)增出4條特異性條帶，在鄂紫薯13中不存在。在這些多態(tài)性條帶中，可能存在NBS-LRR基因的特異擴(kuò)增條帶，這些片段可能與TAO1基因緊密相關(guān)。

3 ?討論

同源序列克隆法具有過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、適用對(duì)象廣泛等優(yōu)點(diǎn)。采用同源序列克隆法在水稻、甘蔗、結(jié)球甘藍(lán)、柚等多種植物上獲得了抗病基因同源序列，顯示了廣泛的應(yīng)用前景[20，21]。這些RGA有的定位在某些抗病基因附近，為分子標(biāo)記輔助育種提供了可能?？共』蛲葱蛄性诳共』虻陌l(fā)掘中起著重要作用，也被廣泛用于NBS-LRR類基因的發(fā)掘。陳觀水等[22]利用同源序列克隆技術(shù)，在甘薯栽培品種青農(nóng)2號(hào)中發(fā)現(xiàn)P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL等4個(gè)與甘薯抗病相關(guān)的基因。屈滿義等[23]對(duì)甘薯高抗莖線蟲(chóng)品種AB94078-1和感病品種徐18進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與抗線蟲(chóng)病相關(guān)聯(lián)的基因序列。Wang等[24]以甘薯品種Jewel為試驗(yàn)材料，在NBS-LRR類基因中發(fā)現(xiàn)與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)的基因。目前， NBS profiling標(biāo)記技術(shù)[26]也被廣泛采用來(lái)尋找NBS-LRR類抗病基因。Calenge等[27]通過(guò)對(duì)產(chǎn)生的43個(gè)標(biāo)記測(cè)序，發(fā)現(xiàn)25個(gè)與蘋果抗瘡病和霉病的重要基因相近的位點(diǎn)。Sayar等[28]利用NBS profiling技術(shù)將土耳其冬小麥栽培品種和哈薩克斯坦冬小麥栽培品種以及歐洲冬小麥栽培品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。

TRAP技術(shù)的固定引物是基于EST序列設(shè)計(jì)的，是表達(dá)基因的一部分，通過(guò)TRAP技術(shù)，能過(guò)開(kāi)發(fā)出與表型或目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記，被有效應(yīng)用于特定基因定位。Miklas等[29]通過(guò)設(shè)計(jì)大豆的TRAP固定引物，在106個(gè)TRAP標(biāo)記中有17個(gè)定位了與R基因相鄰的基因，2個(gè)調(diào)節(jié)灰莖枯萎病抗性，1個(gè)具有大豆花葉病毒抗性和共同的細(xì)菌抗性，證明TRAP標(biāo)記具有標(biāo)記抗病性基因的潛力。任民等[30]直接利用EST序列設(shè)計(jì)TRAP引物，在普通煙草品種中發(fā)現(xiàn)1個(gè)TRAP標(biāo)記特征帶，通過(guò)克隆、測(cè)序和序列對(duì)比，推測(cè)該序列可能是一個(gè)未知的煙草高香氣基因。Chen等[31]結(jié)合SSR和TRAP標(biāo)記，通過(guò)構(gòu)建F2群體，在向日葵中定位了與雄性核不育相關(guān)的基因。Saleh等[32]通過(guò)構(gòu)建小麥Yecora Rojo和Pavon 76的F4群體，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與葉綠素含量性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，4個(gè)與葉片衰老相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記和3個(gè)與葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，表明TRAP標(biāo)記可以用于小麥的抗干旱育種。Chen等[33]結(jié)合SSR、SRAP和TRAP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與小麥抗條銹病相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，證實(shí)YrSph可能是一個(gè)新型的小麥抗條銹病基因。

本研究利用TRAP技術(shù)對(duì)鄂薯11和鄂紫薯13進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)某些條帶在鄂薯11中出現(xiàn)，而在鄂紫薯13中無(wú)法檢測(cè)到，這些條帶可能與甘薯抗病基因有著緊密聯(lián)系，表明TRAP標(biāo)記可能在甘薯的抗病育種中有著應(yīng)用價(jià)值。

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