劉靜

摘要：以茶樹(shù)[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]種子在無(wú)菌條件下萌發(fā)的根和葉為外植體，探究在MS培養(yǎng)基中不同種類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)茶樹(shù)根和葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，以幼根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L，誘導(dǎo)率為85.1%;培養(yǎng)基NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L為幼葉誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為87.0%。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.];愈傷組織;組織培養(yǎng);誘導(dǎo)率

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）18-0149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.036 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Callus induction from tea tree

LIU Jing

（School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China）

Abstract： The effects of different plant growth regulators on the induction of tea[Camellia sinensis（L.） O. Ktze.] root and leaf callus in MS medium were investigated by using the germinated roots and leaves of tea seeds as explants under aseptic conditions. The results showed that the optimum medium for callus induction was NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L， and the induction rate was 85.1%. NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L was the optimal medium for callus induction in young leaves， with an induction rate of 87.0%.

Key words： tea tree[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]; callus; tissue culture; induction rate

茶樹(shù)[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]屬山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，茶葉中含有機(jī)化學(xué)成分和無(wú)機(jī)礦物元素等，具有提神醒腦、解毒、利尿等功效[1]。茶樹(shù)按照繁殖方式的不同分為種子繁殖和無(wú)性繁殖，種子直播簡(jiǎn)單易行，成本低廉，但天然茶樹(shù)種子萌發(fā)受時(shí)間和季節(jié)的影響，并且難以擺脫氣候和環(huán)境的不利影響，育種目的難以真正實(shí)現(xiàn)。無(wú)性繁殖以扦插為主，但是該方法在育苗周期、繁殖系數(shù)、對(duì)環(huán)境的要求方面有一定的缺陷，這使得茶樹(shù)新品種的繁育和推廣速度受到限制[2]，利用組織培養(yǎng)繁殖不僅可以解決上述問(wèn)題，而且具有材料利用率高、育苗周期短、繁殖數(shù)量大、不受季節(jié)影響等諸多優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以茶樹(shù)無(wú)菌苗的幼根和幼葉為外植體，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)補(bǔ)充茶樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)途徑，旨在為茶樹(shù)無(wú)菌苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為陜茶1號(hào)茶樹(shù)成熟蒴果，當(dāng)年10月初采收，種子采收后一部分常溫保存，另一部分在4 ℃條件下冷藏保存。

所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為6-芐氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯乙酸，所需基本培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茶樹(shù)種子的殺菌 ?茶樹(shù)種子剝?nèi)スず?，流水沖洗2 h，用75%乙醇?xì)⒕?0 s，0.1%氯化汞殺菌8 min，無(wú)菌水沖洗5～6次。

1.2.2 ?茶樹(shù)種子的不同處理方法 ?①將低溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子（帶種皮）殺菌后接種在空白MS培養(yǎng)基上。②將低溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子殺菌并去除種皮后接種在空白MS培養(yǎng)基上。③將低溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子殺菌并去除種皮，再將子葉切除2/3后接種于空白MS培養(yǎng)基上。

空白MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂含量為8 g/L，pH為5.8，光照度為1 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d，溫度為25 ℃。30 d后統(tǒng)計(jì)不同處理方法對(duì)茶樹(shù)種子的萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)的影響。

萌發(fā)率=萌發(fā)的種子個(gè)數(shù)/接種的未污染的種子總數(shù)×100%

1.2.3 ?常溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子萌發(fā)率和低溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子萌發(fā)率的比較 ?將常溫儲(chǔ)存和低溫儲(chǔ)存的茶樹(shù)種子殺菌，去除種皮后將子葉切除2/3分別接種于空白MS培養(yǎng)基上。30 d后統(tǒng)計(jì)不同處理方法下茶樹(shù)種子的萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)情況。

萌發(fā)率=萌發(fā)的種子個(gè)數(shù)/接種的未污染的種子總數(shù)×100%

1.2.4 ?茶樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo) ?當(dāng)無(wú)菌苗生長(zhǎng)到3～4 cm時(shí)，將茶樹(shù)無(wú)菌苗的幼根切成0.5 cm長(zhǎng)，無(wú)菌苗的幼葉切成0.5 cm×0.5 cm大小分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，共9種：①NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L;②NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L;③NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L;④NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L;⑤NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑥NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑦NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑧6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L;⑨6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，比較不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（長(zhǎng)出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同處理方法對(duì)低溫儲(chǔ)存種子萌發(fā)率及幼苗生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，冷藏一段時(shí)間的茶樹(shù)種子，其中保留內(nèi)種皮的種子萌發(fā)率為0，去除內(nèi)種皮保留完整子葉的種子萌發(fā)率為84.3%，去除內(nèi)種皮保留1/3子葉的種子萌發(fā)率為90.1%。觀察發(fā)現(xiàn)帶有內(nèi)種皮的茶樹(shù)種子接種2 d后附帶培養(yǎng)基全部褐化，且后期沒(méi)有萌發(fā)跡象（圖1a），在萌發(fā)時(shí)間上，以一芽三葉為培養(yǎng)目標(biāo)，未去除種皮的種子未見(jiàn)萌發(fā)，去除種皮的完整種子（圖1b）萌發(fā)需要的時(shí)間為14 d;萌發(fā)最快的為去除種皮的帶有1/3子葉的種子，只需10 d左右;可能由于茶樹(shù)緊實(shí)的種子結(jié)構(gòu)抑制了芽點(diǎn)的生長(zhǎng)，所以將子葉分開(kāi)后對(duì)芽點(diǎn)的生長(zhǎng)更有利。去除種皮的冷藏種子萌發(fā)率保持在80.0%以上，生長(zhǎng)狀況良好，不僅莖葉茁壯，還有數(shù)條側(cè)根長(zhǎng)出（圖1c）。

2.2 ?不同儲(chǔ)存溫度對(duì)茶樹(shù)種子萌發(fā)率的影響

從表2可以看出，未經(jīng)冷藏的去除內(nèi)種皮保留1/3子葉的茶樹(shù)種子萌發(fā)率為56.0%。種子萌發(fā)所需時(shí)間長(zhǎng)，且生長(zhǎng)緩慢;而經(jīng)過(guò)冷藏的種子萌發(fā)率可達(dá)90.1%，種子萌發(fā)快，幼苗健壯，經(jīng)過(guò)冷藏的去除種皮的種子萌發(fā)率遠(yuǎn)高于未經(jīng)冷藏處理種子，可能是種子內(nèi)部含有脫落酸等抑制萌發(fā)的內(nèi)源性激素，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的冷藏處理，抑制物質(zhì)流失，有利于種子萌發(fā)。

2.3 ?茶樹(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)

2.3.1 ?以無(wú)菌苗的根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織情況 ?在以幼根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中，主要表現(xiàn)為以下幾種情況：第一，幼根接種在培養(yǎng)基上后有部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，繼代培養(yǎng)無(wú)明顯變化或逐漸死亡（圖2a）;第二，愈傷組織生長(zhǎng)速度較慢，通過(guò)30 d的誘導(dǎo)只有少量淡黃色的愈傷組織且質(zhì)地較硬（圖2b），可能由于茶樹(shù)為木本植物，雖然為幼根，但也有少部分木質(zhì)化，導(dǎo)致愈傷組織生長(zhǎng)緩慢且質(zhì)地較硬;第三，愈傷組織的誘導(dǎo)率較低。從表3可以看出，1號(hào)至4號(hào)培養(yǎng)基中，隨著2，4-D的濃度升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯升高，2，4-D的濃度以1.5～2.0 mg/L為宜，超過(guò)或低于這一范圍，愈傷組織的誘導(dǎo)率均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在5號(hào)至7號(hào)培養(yǎng)基中，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，數(shù)量少。8號(hào)培養(yǎng)基無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，綜上所述，以幼根為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為2號(hào)培養(yǎng)基（NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L）。

2.3.2 ?以幼葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織情況 ?茶樹(shù)幼葉在接種后逐漸向上皺卷，膨大變厚，10 d后在外植體切口邊緣出現(xiàn)少量黃白色顆粒狀愈傷組織（圖3a）;30 d后，幼葉切口邊緣的愈傷組織逐漸增多，愈傷組織顏色為黃白色（圖3b）。從表4可以看出，在1號(hào)至4號(hào)培養(yǎng)基中，2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別為83.7%和87.0%，通過(guò)多次繼代培養(yǎng)，可以得到大量淡黃色愈傷組織。5號(hào)至7號(hào)培養(yǎng)基中，在6-BA濃度相同的情況下，愈傷組織隨著NAA濃度的升高，誘導(dǎo)率呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)75.0%。在8號(hào)、9號(hào)培養(yǎng)基中，6-BA的濃度從0.5 mg/L增加到1.0 mg/L，誘導(dǎo)率從24.3%提高至72.4%。誘導(dǎo)出的愈傷組織逐漸由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃綠色，質(zhì)地較松脆。綜上所述，無(wú)論是愈傷組織誘導(dǎo)率還是愈傷組織的質(zhì)量，3號(hào)培養(yǎng)基（NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L）都較為適合。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?茶樹(shù)種子的萌發(fā)

本試驗(yàn)所用茶樹(shù)種子為當(dāng)年10月初采集，其中一部分茶樹(shù)種子常溫保存，另一部分茶樹(shù)種子放置4 ℃冰箱保存，研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)種子的種皮和貯存溫度對(duì)種子萌發(fā)有較大影響，種皮極易引起培養(yǎng)基的褐化，并限制茶樹(shù)種子的萌發(fā)，試驗(yàn)中沒(méi)有去除種皮的種子萌發(fā)率為零，去除種皮的種子有較高的萌發(fā)率，并且低溫儲(chǔ)存的種子萌發(fā)率遠(yuǎn)高于常溫儲(chǔ)存。武田善行等[3]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)種子經(jīng)過(guò)一段時(shí)間冷藏處理后，可促進(jìn)發(fā)芽和顯著提高發(fā)芽整齊度，種子經(jīng)短期低溫處理效果顯著，但隨著冷藏時(shí)間加長(zhǎng)其效果逐漸變小。郭帶英[4]認(rèn)為茶樹(shù)種子在低溫下貯藏能延長(zhǎng)其生命力并保持較高的萌發(fā)率。

3.2 ?茶樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)中對(duì)外植體的選擇

以茶樹(shù)無(wú)菌苗的根和葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，葉愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)較高，陳玉玲等[5]比較了幼莖和葉誘導(dǎo)愈傷組織的效果，認(rèn)為幼莖要好于葉片，葉片的葉脈較葉緣更易產(chǎn)生愈傷組織，局部的褐化對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)影響不大，葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L。奚彪等[6]選擇春季的腋芽為外植體，成功誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得了再生植株，但其成梢率低、生長(zhǎng)慢。目前，已經(jīng)成功利用茶樹(shù)的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)得到完整植株，但對(duì)于最優(yōu)外植體仍然沒(méi)有定論，可見(jiàn)，在外植體的選擇上仍然具有繼續(xù)探索的必要性。

3.3 ?存在的問(wèn)題和今后的研究方向

茶樹(shù)再生體系的建立包括愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代、分化，最后形成具有較高生長(zhǎng)能力的植株這一系列過(guò)程。本試驗(yàn)通過(guò)9種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，部分培養(yǎng)基能夠得到較為理想的愈傷組織，但仍有部分培養(yǎng)基沒(méi)有誘導(dǎo)出愈傷組織，并且已得到的愈傷組織生長(zhǎng)速度慢、數(shù)量少。通過(guò)種子培養(yǎng)出的無(wú)菌苗作為外植體來(lái)源，可以明顯地控制外植體褐化，但仍然有部分根在誘導(dǎo)中發(fā)生褐化并難以改善。雖然有報(bào)道稱(chēng)子葉為茶樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳材料[7]，但在本試驗(yàn)中未能實(shí)現(xiàn)，這將在后期研究中進(jìn)一步探索。茶樹(shù)再生體系的建立，因素多樣，聯(lián)系復(fù)雜，需要調(diào)整的空間較大，所以，還需要大量的研究對(duì)該體系的建立提供技術(shù)支持和完善的理論。

參考文獻(xiàn)：

[1] 邊世平.茶葉的化學(xué)成分及其保健作用[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，22（4）：64-65.

[2] 黃燕芬，吳 ?曦，周?chē)?guó)蘭，等.茶樹(shù)無(wú)菌播種建立植株再生體系[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（5）：60-63.

[3] 武田善行，葉乃興.低溫貯藏對(duì)茶籽發(fā)芽的影響[J].茶葉科學(xué)簡(jiǎn)報(bào)，1994（4）：44.

[4] 郭帶英.茶籽的采收及貯藏對(duì)幼苗成活率的影響[J].廣東茶葉，1986（1）：18-22.

[5] 陳玉玲，馬麗霞，紀(jì)紅冰，等.茶愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，31（3）：389-391.

[6] 奚 ?彪，劉祖生.外植體性質(zhì)對(duì)茶腋芽組培快繁的影響[J].茶葉，1994，20（4）：14-17.

[7] 黃燕芬，周?chē)?guó)蘭，趙華富，等.茶子未成熟胚子葉柄離體培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（3）：31-33.