王鵬程　吳楚　孫智　彭新　韓永世　孫長城　賈切

摘要：為明確引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則測定其致病性，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析鑒定病原菌。結(jié)果表明，引起宜昌市核桃黑斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢

（Alternaria alternata）。

關(guān)鍵詞：核桃黑斑病;分離鑒定;形態(tài)學(xué)觀察;鏈格孢（Alternaria alternata）;宜昌市

中圖分類號：S436.64 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）18-0055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.013 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and identification of a pathogen of walnut black spot in Yichang city

WANG Peng-cheng1，WU Chu2，SUN Zhi1，PENG Xin3，HAN Yong-shi4，SUN Chang-cheng5，JIA Qie2

（1.Hubei Three Gorges Polytechnic， Yichang 443000，Hubei，China;2.College of Horticulture and Gardening，Yangtze University，Jingzhou 434000，Hubei，China;3.Guojiaba Town Forestry Station of Zigui County，Zigui 443621，Hubei，China;4.Zigui County Forestry Bureau，Zigui 443600，Hubei，China;5.Xiakou Town Agricultural Technology Service Center of Xingshan County，Xingshan 443701，Hubei，China）

Abstract： To identify the pathogen causing walnut black spot in Yichang city， the pathogenicity was determined according to Koch's rule. And the pathogenic bacteria was identified by morphological characteristics and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that Alternaria altenata was the pathogen causing walnut black spot in Yichang city.

Key words： walnut black spot; isolation and identification; morphological observation; Alternaria alternata; Yichang city

核桃黑斑病是一種世界性病害[1]，對該病害的研究報道較多[2-6]，普遍認(rèn)為黑斑病具有潛伏期長、發(fā)病時間短、暴發(fā)性強(qiáng)等特點(diǎn);主要為害葉片、嫩枝、幼果及花序。當(dāng)為害葉片時，先在葉片上出現(xiàn)圓形或者不規(guī)則小褐斑，隨著病情發(fā)展，病斑相連成片，最后葉片脫落;為害嫩枝時，在嫩枝上形成黑褐色長條形斑，稍凹陷，最終病斑擴(kuò)展包圍枝條而使上段枯死;花序感病后產(chǎn)生黑褐色水漬狀病斑，造成落花;果實(shí)受害后果面上形成黑褐色小點(diǎn)，隨著病情發(fā)展，病斑不斷擴(kuò)大并逐漸下陷、變黑，果實(shí)腐爛脫落;未脫落的受害果實(shí)干癟皺縮，核殼、核仁變黑，失去食用價值。

目前宜昌市有近4.6×105 hm2核桃樹[7]，當(dāng)?shù)亓謽I(yè)部門把核桃生產(chǎn)作為頭等大事來抓。2018年春在秭歸縣進(jìn)行果樹病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)核桃樹上有疑似核桃黑斑病病害，初步統(tǒng)計病株率高達(dá)30%以上，且呈暴發(fā)之勢。據(jù)當(dāng)?shù)毓r(nóng)反映，這種病害每年都會發(fā)生，且很嚴(yán)重，常規(guī)施藥防治效果不理想，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)睾颂疑a(chǎn)和果農(nóng)的積極性。為有效控制和防治該病害蔓延，對病原進(jìn)行了分離、致病性測定和rDNA-ITS鑒定，初步確定了該病原菌分類定位，期望為探索該病害的防治措施提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品采集 ?2018年5月分別從宜昌市秭歸縣郭家壩鎮(zhèn)白云山村及煙燈堡村核桃種植基地采集具有典型黑斑病癥狀的當(dāng)年生幼嫩枝條，分別放于自封生物標(biāo)本袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，直接分離病原菌或置于冰箱冷藏保存。采集健康核桃葉片及幼嫩枝條用于回接試驗(yàn)，進(jìn)行致病性檢測。

1.1.2 ?試驗(yàn)試劑、儀器與設(shè)備 ?Taq DNA聚合酶、緩沖液體系均由TaKaRa公司提供，定制引物、基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均由上海Sangon公司提供。

普通光學(xué)顯微鏡，E100，日本Nikon公司;PCR儀，9700型，美國ABI公司;DNA測序儀，3730XL型，美國ABI公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株分離純化 ?參照方中達(dá)[8]的方法，將幼嫩枝條沖洗干凈，自然風(fēng)干，用消毒剪刀切取病健交界處約4.0 mm×4.0 mm的組織，放于75%乙醇中消毒10～15 s，再經(jīng)2% NaClO表面消毒4 min，然后用無菌水漂洗3次，最后轉(zhuǎn)至PDA平板上，置于25 ℃恒溫連續(xù)光照條件下培養(yǎng)3～4 d，待菌落長出后，挑取菌落邊緣形態(tài)比較單一的小塊菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上培養(yǎng)，重復(fù)純化2～3次后挑取形態(tài)比較單一的小塊菌絲移至PDA斜面試管中，于25 ℃恒溫連續(xù)光照培養(yǎng)4 d后置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

分離菌株的單孢純化采用分生孢子稀釋法。供試菌株在PDA培養(yǎng)基中25 ℃連續(xù)黑暗培養(yǎng)7 d，加無菌水2 mL，用滅菌棉簽輕洗培養(yǎng)菌落，配制分生孢子懸浮液，然后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，直至普通光學(xué)顯微鏡10×40放大倍率視野中鏡檢到1～2個分生孢子為止;最后將孢子懸浮液均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基平板上。2 d后，再挑取單個分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的單菌落，移至PDA斜面培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?致病性試驗(yàn) ?按照柯赫氏法則，選取新鮮且健康的核桃葉片和幼莖莖段，用75%乙醇表面消毒后再用無菌水沖洗2～3次，放入鋪有濕潤滅菌吸水紙的搪瓷盤中，擺放整齊。用直徑5.0 mm的打孔器在PDA平板上活化培養(yǎng)5 d的菌落邊緣打孔，然后將菌絲塊接種到葉片上，用保鮮膜封盤，置于25 ℃恒溫、12 h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，設(shè)置3次重復(fù)，PDA作為空白對照。接種2 d后移去菌絲塊，連續(xù)10 d觀察發(fā)病情況并進(jìn)行記錄。若癥狀相同，則對發(fā)病組織進(jìn)行再分離，分離得到與原始接種菌株培養(yǎng)特征一致的菌株則可確定為該病的病原菌。

1.3 ?病原菌形態(tài)鑒定

1.3.1 ?菌落培養(yǎng)性狀觀察 ?將直徑5.0 mm的菌絲塊接種到PDA平板上，在25 ℃恒溫連續(xù)光照條件下培養(yǎng)，觀察記錄病原菌的菌落特征以及有無分生孢子產(chǎn)生。

1.3.2 ?產(chǎn)孢表型觀察 ?參照張?zhí)煊頪9]的方法，取濾紙剪成比載玻片小的長方形，將中心挖1 cm左右的小方孔，滅菌后用無菌水潤濕放于無菌載玻片上。然后從活化5 d的菌落邊緣挑取小塊菌絲均勻涂于濾紙中央方孔邊緣，再將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫連續(xù)光照條件下培養(yǎng)2 d后取出載玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗形態(tài)。

1.4 ?菌株rDNA-ITS分子鑒定

1.4.1 ?DNA提取和引物擴(kuò)增 ?取無菌的玻璃紙平鋪在凝固的PDA培養(yǎng)基表面。從活化5 d的菌落邊緣打取直徑6.0 mm菌絲塊，置于玻璃紙上。25 ℃恒溫光照條件下培養(yǎng)，5 d后收集菌落邊緣新鮮菌絲。

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA。取6 μL DNA瓊脂糖凝膠液電泳檢測，用英國Syngene G：BOX EF 2凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

采用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

1.4.2 ?PCR反應(yīng)體系與ITS序列分析 ?PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，反應(yīng)液組分為：10×PCR Buffer（含MgCl2）5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，加ddH2O使總體積達(dá)到50 μL，在PTC-100 PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行DNA純化和測序。測序結(jié)構(gòu)登錄NCBI進(jìn)行Blast比對。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?病原菌菌落形態(tài)

將所采病樣經(jīng)過3次單菌落分離和純化，獲得1株真菌，編號為JF1。初期菌落生長較慢，菌絲絨毛狀，白色，菌落近圓形，較整齊，隨著菌落不斷擴(kuò)大，菌落顏色逐漸呈淺灰色或深灰色;氣生菌絲致密厚實(shí)，無異味。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基觀察，背面灰黑色至黑色，呈同心輪紋狀（圖1）。

2.2 ?菌種形態(tài)觀察

取出載玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察，JF1菌絲單生或有分枝，有隔，有鎖狀聯(lián)合。分生孢子梗鏈短、分枝較多，直立或彎曲;分生孢子黃褐色，倒棒狀、倒梨形或橢圓形，臍部明顯，具有若干橫、縱隔膜，分隔處平滑或縊縮，頂部有鳥嘴狀突起的喙，初步判斷為鏈格孢屬真菌（圖2）。

2.3 ?菌株致病性確定

取菌絲塊分別接種到活體核桃葉片和幼莖上，3 d后該菌在核桃莖干（圖3a）和葉片（圖3b）上開始出現(xiàn)病斑，繼續(xù)培養(yǎng)，病斑不斷擴(kuò)大（圖3b、圖3c），持續(xù)觀察10 d并記錄癥狀變化情況，發(fā)現(xiàn)此癥狀與之前采樣的核桃病癥一致（圖3）。

2.4 ?菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測

按試劑盒操作說明及相關(guān)方法從菌體中提取出基因組DNA，提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰、較明亮，可以作為PCR反應(yīng)的模板;以DNA為模板，ITS1、ITS4為引物，對rDNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約為562 bp。

2.5 ?rDNA-ITS序列分析

ITS序列長度為562 bp，提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，登錄號為MF785102.1、JF439442.1、MH619630.1。其中，MF785102.1（Alternaria alternata）相似度達(dá)100%。進(jìn)一步結(jié)合MEGA 7.0分子軟件，以5種鏈格孢屬種即鏈格孢（Alternaria alternata）、蘆薈黑斑病菌（Alternaria aborescens）、空心蓮子草黑斑病菌（Alternaria alternantherae）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）和向日葵黑斑病菌（Alternaria helianthi）在GenBank已知的ITS序列為參照，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，JF1菌株與4株Alternaria alternata（HQ257255、GU566303、GQ249171和AB470838）聚為一支，相似度為86%，鏈格孢屬其他菌株所在分支按相似度不同與其并列。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將其鑒定為Alternaria alternata。

3 ?討論

鏈格孢屬真菌是世界性分布的真菌，包括腐生、內(nèi)生和致病性等種類[10]。據(jù)報道，95%以上的鏈格孢種類兼性寄生于植物上，代謝產(chǎn)物即毒素可導(dǎo)致受害植物產(chǎn)生各種癥狀，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[11]。自從2002年Belisario等[12]在核桃樹的病斑上分離到鏈格孢屬真菌后，鏈格孢對核桃的危害開始引起人們關(guān)注;Hong等[13]認(rèn)為有3種鏈格孢可侵染核桃，分別是鏈格孢、細(xì)極鏈格孢和樹狀鏈格孢;在致病過程方面，Moragrega等[14]認(rèn)為鏈格孢屬真菌既能夠單獨(dú)致病，又可與其他病原生物共同致病;曲文文等[15，16]在山東省也從核桃病斑中分離出了鏈格孢屬真菌，認(rèn)為鏈格孢是造成核桃黑斑病和頂端褐色壞死的主要病原菌。本試驗(yàn)在宜昌市也分離到鏈格孢屬真菌，認(rèn)為鏈格孢屬真菌是造成宜昌市地區(qū)核桃黑斑病的主要病原菌之一。

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