張禹　徐聲偉　何恩慧　肖桂花　宋軼琳　高飛　王蜜霞　蔡新霞

摘?要?深腦核團(tuán)電刺激（DBS）已成為改善帕金森病人運(yùn)動障礙的有效治療手段，然而其確切的治療機(jī)制仍然不明。目前， DBS機(jī)制探究系統(tǒng)多由電刺激儀器和信號檢測儀器兩部分構(gòu)成，多臺實(shí)驗(yàn)設(shè)備的長期開啟易產(chǎn)生操作程序復(fù)雜、環(huán)境噪聲增多和資源浪費(fèi)等問題。本研究建立了一套綜合性實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，包括將電刺激功能與神經(jīng)雙模信號檢測功能集成的神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器和基于微機(jī)電加工技術(shù)制備的微電極陣列（MEA）。在體實(shí)驗(yàn)前，對經(jīng)納米鉑黑和Nafion膜修飾的MEA進(jìn)行體外標(biāo)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1～50 μmol/L多巴胺（DA）溶液與修飾后的電極表面氧化電流值呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.998。隨后，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了以前腦內(nèi)側(cè)束為電刺激靶點(diǎn)，紋狀體為神經(jīng)信息檢測核團(tuán)的活體大鼠實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紋狀體內(nèi)DA濃度在刺激后迅速上升，最高達(dá)2.06 μmol/L， 約為刺激前水平的1.57倍;神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放率增加，由刺激前的1.17 Hz上升至6.77 Hz;場電位活動增強(qiáng)，功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW。本研究設(shè)計(jì)并制備的神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了電刺激與雙模信號檢測的功能集成，有望為DBS治療機(jī)制的探究提供有效實(shí)驗(yàn)工具。

關(guān)鍵詞?深腦核團(tuán)電刺激; 微電極陣列; 多巴胺; 神經(jīng)電生理信號; 神經(jīng)遞質(zhì)

1?引 言

帕金森疾病是一種影響全世界數(shù)百萬人的神經(jīng)退行性疾病，主要的病理變化為紋狀體內(nèi)多巴胺（DA）濃度的明顯減少和黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失[1～3]，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運(yùn)動遲緩、肌肉僵直和靜止性震顫等運(yùn)動癥狀，以及嗅覺障礙、睡眠障礙和抑郁等非運(yùn)動癥狀[4，5]。20世紀(jì)90年代以來，深腦核團(tuán)電刺激（DBS）被認(rèn)為是減輕帕金森疾病中藥物難治性運(yùn)動癥狀的有效治療手段[6～8]，通過對腦內(nèi)特定神經(jīng)核團(tuán)施加一定參數(shù)的電脈沖，達(dá)到減輕病態(tài)癥狀的效果。為探究DBS的治療機(jī)制，研究者多采用包括電刺激器和單模信號檢測儀器在內(nèi)的兩套獨(dú)立儀器[9，10]，多臺實(shí)驗(yàn)設(shè)備的長期開啟易造成操作步驟繁瑣、環(huán)境噪聲增多和資源浪費(fèi)等問題，不利于腦內(nèi)微弱信號的測量。

前腦內(nèi)側(cè)束（MFB）作為黑質(zhì)?紋狀體通路中重要的神經(jīng)核團(tuán)，被認(rèn)為是基底節(jié)回路中有效的電刺激靶點(diǎn)之一[11]。研究者通過碳纖維電極探測的方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MFB?DBS后，紋狀體內(nèi)DA濃度有所升高[12]，但由于缺少對神經(jīng)電生理信號的同步記錄，紋狀體內(nèi)神經(jīng)元在刺激前后神經(jīng)信息的綜合性變化未得到直觀描述。

為解決上述問題，在前期工作的基礎(chǔ)上[13，14]，本研究設(shè)計(jì)并建立了一套綜合性實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，包括將電刺激功能和神經(jīng)雙模信號檢測功能集成的神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器和經(jīng)納米材料修飾的微電極陣列（MEA）生物傳感器?；诖讼到y(tǒng)開展活體動物實(shí)驗(yàn)，通過向大鼠MFB施加電刺激，同步觀察紋狀體內(nèi)DA的濃度變化和神經(jīng)元的放電情況。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器

本研究基于 LabVIEW 虛擬儀器開發(fā)平臺，在實(shí)驗(yàn)室原有的雙模信號檢測系統(tǒng)[15，16]的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)并制備了集成電刺激功能和神經(jīng)雙模信號檢測功能于一體的神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器（圖1）。

2.1.1?儀器電源部分?此儀器采用15 V統(tǒng)一單向供電。電刺激部分利用高壓直流電源變換為低壓直流電源模塊（DCDC）和低壓差線性穩(wěn)壓器（LDO）將15 V單向電源轉(zhuǎn)換為±12 V雙向供電。電生理檢測部分和電化學(xué)檢測部分利用DCDC和LDO將15 V單向供電值轉(zhuǎn)換為±5 V雙向供電。

2.1.2?電刺激部分?本系統(tǒng)設(shè)計(jì)的電刺激模塊提供矩形波、正弦波、三角波和用戶自定義方波等基本刺激圖形，供用戶選擇，用戶可通過上位機(jī)軟件對所選波形進(jìn)行參數(shù)編輯（脈沖幅值、脈沖寬度、正負(fù)脈沖間隔和脈沖數(shù)量），確定后的刺激波形由采集卡的模擬信號輸出口輸出。當(dāng)用戶選擇電壓信號刺激時(shí)，采集卡的輸出將經(jīng)過一個(gè)電壓跟隨器輸出至刺激電極; 當(dāng)用戶選擇電流信號刺激時(shí)，采集卡輸出的電壓將經(jīng)過一個(gè)電壓?電流轉(zhuǎn)換電路再輸出至刺激靶點(diǎn)。數(shù)據(jù)采集卡采用美國 NI 公司的USB6255 OEM，具有2個(gè)模擬信號輸出口。

2.1.3?神經(jīng)信息檢測部分?神經(jīng)信息檢測部分包括4通道的神經(jīng)電化學(xué)信號檢測模塊和64通道的神經(jīng)電生理信號檢測模塊。神經(jīng)電化學(xué)信號檢測方面，以包括工作電極、對電極和參比電極在內(nèi)的三電極體系作為設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。利用采集卡的模擬信號輸出功能，實(shí)現(xiàn)工作電極上氧化/還原電位的施加; 利用電流?電壓轉(zhuǎn)換放大電路和采集卡模擬信號采集功能，將神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)所引起的電流變化轉(zhuǎn)換為電壓信號，并放大至mV級被采集卡采回。神經(jīng)電生理信號檢測方面，由于神經(jīng)電生理信號為μV級的微弱信號，過長的傳輸距離易使信號發(fā)生畸變、失真。因此，在信號進(jìn)入主放大濾波電路前，首先在傳感器的末端接入放大倍數(shù)為10的前置放大器，進(jìn)行信號的第一次放大，隨后利用漆包線將信號傳至主放大濾波電路，再進(jìn)行100倍的第二次放大，最終不易受環(huán)境影響的mV級電壓信號被采集卡的模擬信號采集端口采回。

2.2?其它儀器與試劑

KH2200E 超聲振蕩器（中國合創(chuàng)公司）; ?BX51TRF光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）; S?800 掃描電鏡（日本 Hitachi 公司）; 腦立體定位儀（美國Stoelting公司）; 50?12?1C液壓探針驅(qū)動器（美國FHC公司）; MW?D20 實(shí)驗(yàn)室超純水器（中國美誠公司）; 雙極型同心圓電刺激電極（美國Microprobes公司）; 128 通道模擬神經(jīng)信號發(fā)生器（Blackrock 公司）。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， Na2HPO4NaH2PO4KCl， pH 7.4，美國Sigma公司）; 多巴胺（DA）、二羥基苯乙酸（DOPAC），谷氨酸（Glu）和抗壞血酸（AA）（美國Alfa Aesar公司）; 氯鉑酸（H2PtCl6）和醋酸鉛（Pb （CH3COO）2）（中國國藥化學(xué)試劑）; 生理鹽水（中國雙鶴制藥公司）; Nafion陽離子交換膜（美國Sigma公司）。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在室溫下進(jìn)行。

2.3?微電極陣列的制備

所使用的16通道微電極陣列[15]是基于微機(jī)電加工工藝技術(shù)，以硅片為基底，以鉑（厚度250 nm）為導(dǎo)電層，以氧化硅（厚度300 nm）和氮化硅（厚度500 nm）為雙絕緣層進(jìn)行制備。在體實(shí)驗(yàn)前，為降低電極位點(diǎn)的阻抗值，將納米材料修飾在電極表面。 2 mmol/L H2PtCl6和2 mmol/L Pb（CH3COO）2按體積比1∶1混合后作為電鍍液，MEA為工作電極，Pt為對電極，采用兩電極體系的計(jì)時(shí)電流法（?1 V，50 s）電鍍納米鉑黑。其中，Pb2+的加入更有利于生成大量的、小尺寸鉑黑納米粒子[16～18]。為提高M(jìn)EA對DA的選擇性，將Nafion膜涂覆在位點(diǎn)表面，并通過100℃的紅外探照燈加熱30 min將其烘干。

2.4?實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1?神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器的性能測試?為驗(yàn)證神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測儀器的功能可行性，利用電刺激模塊向外施加雙向矩形波電刺激（100 Hz，200 μA，1 s）; 通過信號發(fā)生器的輸出模擬神經(jīng)電生理信號; 通過在100 MΩ金屬膜電阻兩端施加+0.5 V電位模擬神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)電流，以此觀察儀器的電刺激輸出情況和雙模信號檢測情況。對于采集卡采回的結(jié)果，一方面，將刺激輸出的實(shí)際電壓值與上位機(jī)軟件設(shè)置的電壓值進(jìn)行比較，證明電刺激輸出的準(zhǔn)確性; 另一方面，通過觀察電刺激施加前后神經(jīng)信號檢測模塊檢測到的信號幅值變化，探究電刺激模塊與檢測模塊的串?dāng)_情況。

2.4.2?微電極陣列的基本性能測試

在體實(shí)驗(yàn)前，使用以MEA為工作電極、Ag|AgCl為參比電極，Pt為對電極所構(gòu)成的三電極體系探究DA濃度與電極表面氧化電流之間的關(guān)系。具體地，氧化電壓值設(shè)置為+0.5 V，1～50 μmol/L DA溶液依次滴加至PBS中，觀察電極表面氧化電流值的變化。

為探究MEA的抗干擾性能，參考紋狀體內(nèi)各個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度[19～22]，100 μmol/L UA、30 μmol/L DOPAC、1 μmol/L Glu和300 μmol/L AA被依次滴加至PBS中，觀察電極位點(diǎn)的氧化電流值變化。

2.4.3?電刺激下的雙模檢測實(shí)驗(yàn)?為驗(yàn)證系統(tǒng)的可行性及探究電刺激下紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的活動變化，本研究基于神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了以MFB為刺激靶點(diǎn)，以紋狀體為檢測靶點(diǎn)的DBS實(shí)驗(yàn)。選取200～300 g健康雄性大鼠，經(jīng)20%烏來糖（0.7 ml/100 g）麻醉后進(jìn)行開顱手術(shù)。電推進(jìn)器以每隔5 min下降500 μm的速度將電刺激電極植入至前腦內(nèi)側(cè)束（AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm，DV：8.4 mm）， 到達(dá)目標(biāo)區(qū)域后，利用牙科水泥將其固定; 將微電極陣列以10 μm/s的速度植入至紋狀體（AP： 1.08 mm， ML： 2.8 mm，DV： 4～5 mm），其中8個(gè)通道作為神經(jīng)電生理信號檢測通道，1個(gè)通道作為神經(jīng)遞質(zhì)DA的檢測通道。Ag|AgCl參比電極和顱骨釘?shù)奈恢梅謩e為AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm和AP： 6.72 mm， ML： 2.8 mm。植入電極后，待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定，將多巴胺氧化電壓值設(shè)置為+0.5 V，進(jìn)行電刺激下的紋狀體內(nèi)神經(jīng)信息記錄。其中，電刺激參數(shù)設(shè)置為雙向方波，刺激頻率100 Hz， 刺激幅值200 μA， 刺激脈沖數(shù)100 plus，持續(xù)時(shí)間為1 s。

3?結(jié)果與討論

3.1?神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測系統(tǒng)的性能測試在電刺激方面，對比上位機(jī)設(shè)置的電流值，儀器輸出的電流值準(zhǔn)確度>96%。在電生理信號采集方面，電壓信號能夠被成功地采回至采集卡，并且進(jìn)行顯示與保存; 當(dāng)電刺激輸出時(shí)，刺激前后信號基線無明顯變化（圖2A）; 在電化學(xué)信號采集方面，準(zhǔn)確的電流值被采集卡實(shí)時(shí)采回，在上位機(jī)顯示; 刺激前后電化學(xué)信號電流基線無明顯變化（圖2B）。此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了電刺激模塊、電生理信號檢測模塊和電化學(xué)信號檢測模塊都能夠很好地工作，并且相互之間沒有產(chǎn)生明顯干擾。

3.2?微電極陣列的基本性能

與裸電極相比（圖3A），修飾后的位點(diǎn)集聚了大量的納米鉑黑顆粒（圖3B），極大地增加了電極與神經(jīng)元的接觸面積。電極體外標(biāo)定結(jié)果表明，1～50 μmol/L DA溶液與電極表面氧化電流值呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.998，對應(yīng)斜率為12.254 pA/μmol/L（圖4A和圖4B）。干擾物測試結(jié)果表明，修飾后的電極對UA、DOPAC和Glu幾乎無響應(yīng)，對AA的響應(yīng)為9 pA（圖4C）。因此，干擾物對DA測量的影響很小。

3.3?電調(diào)控下紋狀體內(nèi)神經(jīng)信號檢測結(jié)果

活體動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。MFB?DBS后，DA濃度迅速升高，最高達(dá)2.06 μmol/L，約為刺激前水平的1.57倍。與此同時(shí)，神經(jīng)元發(fā)放活動和場電位波動情況明顯增多。經(jīng)過主成分分析和聚類分析得到的動作電位波形如圖6A所示，峰值范圍為128.44～807.34 μV， 且具有較長的復(fù)極化時(shí)間（2.1 ms）。神經(jīng)元的發(fā)放率由穩(wěn)定狀態(tài)的1.17 Hz上升至6.77 Hz， 相比于未刺激之前增加約5.7倍（圖6B）。相似地，代表細(xì)胞群體特征的場電位信號，

在受到刺激后，高頻活動得到明顯提升（圖6C），場電位活動功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW（圖6D）。

4?結(jié) 論

設(shè)計(jì)并建立了一套神經(jīng)電調(diào)控?雙模信號檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了電刺激施加、神經(jīng)電化學(xué)信號檢測和神經(jīng)電生理信號檢測的功能集成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器內(nèi)部的刺激模塊與檢測模塊能夠有效地工作，相互之間未造成明顯的信號干擾。基于此系統(tǒng)開展的體外標(biāo)定實(shí)驗(yàn)表明，修飾后的微電極陣列對于1～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)的多巴胺溶液具有良好的氧化電流響應(yīng); 對于UA、DOPAC、Glu、AA等常見干擾物的響應(yīng)極低。通過設(shè)計(jì)MFB?DBS大鼠實(shí)驗(yàn)，不僅驗(yàn)證了整個(gè)系統(tǒng)可良好地應(yīng)用于活體動物實(shí)驗(yàn)，而且說明了MFB?DBS具有提高紋狀體內(nèi)多巴胺濃度和促進(jìn)神經(jīng)元興奮性發(fā)放的作用。

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Neural Electrostimulation?Detection System and

Experimental Validation of Deep Brain Nuclei in Vivo

ZHANG Yu1，2， ?XU Sheng?Wei1，2， ?HE En?Hui1，2， ?XIAO Gui?Hua1，2，

SONG Yi?Lin1，2， ?GAO Fei1，2， ?WANG Mi?Xia1，2， ?CAI Xin?Xia1，2

1（State Key Laboratory of Transducer Technology， ?Institute of Electronics，

Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100190， ?China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100049， ?China）

Abstract?Although deep brain stimulation （DBS） has become an effective treatment for improving dyskinesia in Parkinson's disease， ?the exact treatment mechanism remains unclear. In addition， ?the current system researching DBS mechanism is always composed of two individual parts： the electrical stimulation instrument and the signal detection instrument， ?which makes it easy to cause the complicated operation of procedure and the waste of resource. In this work， ?a comprehensive experimental system was established， ?including an electrostimulation?detection instrument which integrated the function of electrical stimulation and neural signal detection， ?and the microelectrode arrays （MEA） which were fabricated by micro?electro?mechanical system （MEMS） and modified by nanoplatinum and nafion membrane. Experimental results showed that dopamine in concentration range of 1-50 μmol/L had a good linear relationship with the surface oxidation current of the modified MEA， ?and the linear correlation coefficient was 0.998. What's more， ?DBS was designed with the medial forebrain bundle （MFB） as stimulation target and the striatum as detection area， ?which made the striatal simultaneous observation of dopamine concentration and neuronal firing was achieved while electrical stimulation was applied. Experimental results indicated that the concentration of dopamine in the striatum increased rapidly after stimulation， ?reaching a maximum of 2.06 μmol/L which was about 1.57 times of the pre?stimulation level; the spike firing rate increased from 1.17 Hz to 6.77 Hz; and the power of local field potential was enhanced from 0.19 mW to 0.64 mW. The electrostimulation?detection system developed in this study realized the integration of electrical stimulation and dual?mode signal detection， ?which simplified the complex experimental steps and was expected to provide an effective experimental tool for the exploration of DBS treatment mechanism.

Keywords?Deep brain stimulation; Microelectrode arrays; Dopamine; Neuro?electrophysiological signal; Neurotransmitters